[發(fā)明專利]可以同時(shí)檢測(cè)尿液和血清樣本中視黃醇結(jié)合蛋白的試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310061223.4
• 申請(qǐng)日: 2013-02-27
• 公開（公告）號(hào): CN103134934A
• 公開（公告）日: 2013-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄒炳德;鄒繼華;方亮;劉獻(xiàn)文;周海濱
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 寧波美康生物科技股份有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/577
• 分類號(hào): G01N33/577;G01N21/31
• 代理公司: 寧波市鄞州甬致專利代理事務(wù)所(普通合伙) 33228
• 代理人: 代忠炯

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種可以同時(shí)檢測(cè)尿液和血清樣本中視黃醇結(jié)合蛋白的試劑盒。

背景技術(shù)

視黃醇結(jié)合蛋白（Retinol-Binding?protein,RBP）是血液中的視黃醇（維生素A）的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，參與血清和細(xì)胞內(nèi)視黃醇/酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，它是主要在肝臟中合成，并釋放入血液而進(jìn)入各種組織，通過與視黃醇、前白蛋白及細(xì)胞表面受體相互作用，在維生素A的儲(chǔ)存、代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)到周圍靶器官中具有重要功能。在血液中，RBP主要以視黃醇、前白蛋白結(jié)合的復(fù)合物形式存在，當(dāng)復(fù)合物中視黃醇與靶細(xì)胞結(jié)合后，RBP便與前白蛋白分離，自腎小球?yàn)V出，由近端腎小管上皮細(xì)胞吸收、降解。RBP功能障礙會(huì)導(dǎo)致維生素A的儲(chǔ)存、轉(zhuǎn)運(yùn)、分布及代謝異常，進(jìn)而引發(fā)各種疾病，并影響上皮和骨組織的生長(zhǎng)、分化、繁殖與胚胎發(fā)育等，因此RBP在腎功能檢查中，作為早期腎病的診斷指標(biāo)，在門診、健康診斷等領(lǐng)域中被廣泛使用。

目前臨床上廣泛使用的RBP檢測(cè)方法是免疫比濁法。但普通免疫比濁法檢測(cè)方法由于采用單一多克隆抗體，導(dǎo)致其具有特異性好但靈敏度差或者靈敏度好但特異性差的特點(diǎn)，無法同時(shí)滿足特異性和靈敏度要求。其中中國(guó)國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局網(wǎng)站上公開了一種雙抗體復(fù)合的視黃醇結(jié)合蛋白檢測(cè)試劑盒，采用單克隆抗體和多克隆抗體混合普通免疫比濁法，可以同時(shí)滿足特異性和靈敏度的要求，但采用普通免疫比濁法，其抗體用量較大，而且單克隆抗體成本較高，限制了其臨床應(yīng)用。中國(guó)國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局網(wǎng)站上還公開了一種基于膠乳粒子包被視黃醇結(jié)合蛋白檢測(cè)試劑盒，采用多克隆抗體膠乳增強(qiáng)法，大大減少了抗體用量，降低了成本，但其檢測(cè)線性范圍較窄，無法同時(shí)用于血清中RBP和尿液中RBP的測(cè)定。中國(guó)國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局網(wǎng)站上還公開了一種雙抗體乳膠增強(qiáng)視黃醇結(jié)合蛋白檢測(cè)試劑盒，采用兩種單克隆抗體膠乳增強(qiáng)法，其線性范圍較寬，但靈敏度低，仍然無法同時(shí)用于血清中RBP和尿液中RBP的測(cè)定。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足而提出一種具有高靈敏度、寬線性、特異性好且抗體用量少、降低了成本且可以同時(shí)檢測(cè)尿樣本和血清樣本中視黃醇結(jié)合蛋白的檢測(cè)試劑盒。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：一種可以同時(shí)檢測(cè)尿樣本和血清樣本中視黃醇結(jié)合蛋白的檢測(cè)試劑盒，包括試劑R1和試劑R2，所述試劑R1為含有具有促進(jìn)凝聚作用的多聚物緩沖液，所述試劑R2是含有乳膠-抗體交聯(lián)物的緩沖液，其中乳膠-抗體交聯(lián)物是標(biāo)記有抗人視黃醇結(jié)合蛋白多克隆抗體的大膠乳顆粒和標(biāo)記有抗人視黃醇結(jié)合蛋白單克隆抗體的小膠乳顆粒。

作為優(yōu)選，所述抗人視黃醇結(jié)合蛋白多克隆抗體是含有功能部位的完整抗體或抗體片段，包括兔抗人多克隆抗體或羊抗人多克隆抗體；所述抗人視黃醇結(jié)合蛋白單克隆抗體為含有功能部位的完整抗體、抗體片段或重組抗體。

進(jìn)一步地，所述大膠乳顆粒為粒徑在120～400nm之間的聚苯乙烯膠乳，大膠乳顆粒占試劑R2的質(zhì)量百分比為0.01～0.1％。

進(jìn)一步地，所述小膠乳顆粒為粒徑在30～150nm之間的聚苯乙烯膠乳，小膠乳顆粒占試劑R2的質(zhì)量百分比為0.1～0.5％。

進(jìn)一步地，所述大膠乳顆粒為粒徑在160～300nm之間的聚苯乙烯膠乳，大膠乳顆粒占試劑R2的質(zhì)量百分比為0.02～0.05％。

進(jìn)一步地，所述小膠乳顆粒為粒徑在60～120nm之間的聚苯乙烯膠乳，小膠乳顆粒占試劑R2的質(zhì)量百分比為0.1～0.3％。

更進(jìn)一步地，所述試劑R2中大膠乳顆粒和小膠乳顆粒的混合比例為1︰4～14。

本發(fā)明采用復(fù)合的單克隆、多克隆抗體致敏的膠乳增強(qiáng)免疫檢測(cè)方法，開發(fā)出可同時(shí)檢測(cè)血清和尿液中RBP的檢測(cè)試劑盒。復(fù)合的單克隆、多克隆抗體致敏的膠乳增強(qiáng)免疫檢測(cè)方法的反應(yīng)原理是：將包被了高特異性的抗人視黃醇結(jié)合蛋白多克隆抗體的大膠乳顆粒和高特異性的抗人視黃醇結(jié)合蛋白單克隆抗體的小膠乳顆粒混合于稀釋液，與樣本中相應(yīng)的RBP抗原發(fā)生特異性結(jié)合，形成不溶性的抗原-抗體-膠乳顆粒復(fù)合物，產(chǎn)生一定的濁度，其濁度高低與樣本中的RBP抗原濃度成正比關(guān)系，在一定波長(zhǎng)下進(jìn)行濁度測(cè)定，即可測(cè)得樣本中被檢測(cè)RBP的含量。

本發(fā)明中，選取的檢測(cè)波長(zhǎng)為340～800nm，優(yōu)選600nm。

采用本發(fā)明所述的試劑盒測(cè)定血清或尿液中RBP時(shí)，先將樣本與試劑R1混勻后孵育5分鐘，然后加入試劑R2，立即讀取第一點(diǎn)吸光度值（A1），計(jì)時(shí)反應(yīng)5分鐘后，讀取第二點(diǎn)吸光度值(A2)，計(jì)算兩點(diǎn)吸光度差值，根據(jù)校準(zhǔn)曲線得到樣本中RBP的含量。