[發(fā)明專利]一種博來霉素族衍生物的分離和純化方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310060071.6
• 申請日: 2013-02-26
• 公開（公告）號: CN104004065B
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 段燕文;沈奔;朱湘成;楊虎
• 申請（專利權(quán)）人: 長沙天賜生物醫(yī)藥科技有限公司;長沙慈航藥物研究所有限公司;哈藥慈航制藥股份有限公司
• 主分類號: C07K9/00
• 分類號: C07K9/00;C07K1/36;C07K1/18
• 代理公司: 長沙正奇專利事務(wù)所有限責(zé)任公司43113
• 代理人: 馬強

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從黃綠鏈霉菌重組工程菌SB9026的發(fā)酵液中高效分離和純化新型活性博來霉素族衍生物6’-脫羥基-BLM S的方法。

背景技術(shù)

腫瘤是危害人類健康的嚴重疾病之一,目前全世界有惡性腫瘤病人約1400萬，我國每年癌癥發(fā)病人數(shù)約180萬至200萬，死亡140萬至150萬。我國居民每死亡5人中，即有1人死于癌癥。世界衛(wèi)生組織預(yù)測，到2020年，每年新發(fā)癌癥病人數(shù)將達到1500萬，癌癥已經(jīng)成為新世紀人類的第一殺手，并成為全球最大的公共衛(wèi)生問題。

博萊霉素(Bleomycin，縮略BLM)是從輪枝鏈霉菌(Streptomyces verticillus)中分離發(fā)現(xiàn)的一類糖肽類抗腫瘤抗生素，目前已發(fā)現(xiàn)十余種博萊霉素天然組分，其中主要成分為博萊霉素A2(55％～70％)和博萊霉素B2(25％～32％)。隨后發(fā)現(xiàn)的泰萊霉素、佐伯霉素和腐草霉素等糖肽類天然產(chǎn)物與博萊霉素的結(jié)構(gòu)和活性都極為相似，因此這一類天然產(chǎn)物被統(tǒng)稱為博萊霉素族糖肽類抗腫瘤抗生素。博萊霉素族抗生素能夠選擇性地誘導(dǎo)單鏈或雙鏈DNA的斷裂，從而抑制腫瘤細胞DNA合成和復(fù)制。以BLM A2和B2為主要成分的商品藥作為一種重要的有效抗腫瘤藥物，在臨床上與其他試劑一起聯(lián)合廣泛應(yīng)用于治療睪丸癌，及霍奇金淋巴瘤、鱗狀上皮細胞癌、生殖細胞瘤和其他腫瘤。但是，博萊霉素誘導(dǎo)的劑量依賴性肺纖維化作為主要的副作用嚴重限制了其在臨床的應(yīng)用。

要推廣博萊霉素類化合物在臨床上的應(yīng)用，就必須解決其誘導(dǎo)的肺毒性以及腫瘤細胞逐漸形成的耐藥性等關(guān)鍵性問題，因此必須開發(fā)新型的高效低毒的博萊霉素族衍生物。因為博萊霉素族化合物的分子結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，所以通過傳統(tǒng)的化學(xué)全合成方法來獲取其相關(guān)衍生物的過程及其繁瑣且效率低下，無法滿足臨床研究的需要和工業(yè)化生產(chǎn)的應(yīng)用，并且合成的博萊霉素衍生物也并未展示出更好的活性或更低的毒性。新興的組合生物合成方法通過遺傳操縱次代謝產(chǎn)物生物合成基因來獲取目標(biāo)天然產(chǎn)物衍生物，是一種非常有應(yīng)用前景的高新技術(shù)。

專利申請?zhí)?01110276318.9，從佐伯霉素的原始高產(chǎn)菌株黃綠鏈霉菌SB9001出發(fā)，我們應(yīng)用基因重組技術(shù)將黃綠鏈霉菌SB9001中的zbmVIII基因完全失活后得到不生產(chǎn)佐伯霉素的黃綠鏈霉菌突變株，然后以該突變株作為異源宿主，將包含完整博萊霉素生物合成基因簇(blm基因簇)的人造細菌染色體質(zhì)粒blm1-6E轉(zhuǎn)入其中獲得黃綠鏈霉菌重組工程菌SB9026(保藏號CCTCC M 2011292)。從該重組工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)物中我們成功得到一種新型博萊霉素衍生物6’-脫羥基-BLM S，并且初步生物活性測試表明6’-脫羥基-BLM S的DNA裂解活性至少是博萊霉素-A₂的10倍以上。這說明在更少用量的條件下，6’-脫羥基-BLM S比目前臨床使用的任何一種博萊霉素類抗癌藥物的毒性都要低，因此作為迄今為止發(fā)現(xiàn)的最有效的博萊霉素衍生物，6’-脫羥基-BLM S很有希望成為博萊霉素族化合物中的新型抗癌藥物。因此，無論是從現(xiàn)階段研究的需要，還是將來工業(yè)化應(yīng)用的需求，如何建立一套快速高效的6’-脫羥基-BLM S的分離純化方法都迫在眉睫。

發(fā)明內(nèi)容

現(xiàn)有的分離純化方法步驟較多，增加了生產(chǎn)的成本和目標(biāo)產(chǎn)物在過程中的損耗；尤其是最后通過EDTA進行脫銅精制的步驟，使得6’-脫羥基-BLM S的回收率大大降低。針對以上現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種利用黃綠鏈霉重組工程菌SB9026來高效合成新型活性博萊霉素衍生物的分離和純化方法，該方法簡化并減少了分離純化步驟，降低了生產(chǎn)成本，提高了脫銅率，增加了目標(biāo)產(chǎn)物的回收率。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種博來霉素族衍生物的分離和純化方法，具體步驟為：

(1)收集黃綠鏈霉重組工程菌SB9026經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)后得到的發(fā)酵液，加入十二水合硫酸鋁鉀，每升發(fā)酵液中加入十二水合硫酸鋁鉀0.4g-0.6g，充分攪拌后，靜置25-30分鐘后再加入硅藻土，每升發(fā)酵液中加入硅藻土5g-6g，攪拌后進行固液分離，得到pH值為6-8的發(fā)酵上清液；所述黃綠鏈霉重組工程菌SB9026的保藏號為CCTCC M 2011292；