[發明專利]一個高效抽提茄科類種子RNA的方法

無效

• 申請號: 201310059916.X
• 申請日: 2013-02-26
• 公開（公告）號: CN103074330A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發明（設計）人: 韓芹芹;高凱;宋玉竹;張金陽
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體是從茄科類植物新鮮種子或者干種子中抽提RNA的方法。

背景技術

人類食物的70%是直接來源于植物種子，種子還是植物遺傳資源的主要載體。在種子形成、萌發和幼苗建成等領域的研究中，基因動態表達、cDNA文庫構建、基因克隆、體外翻譯等以RNA分子為基礎的分子生物學研究需要足夠量和高質量的RNA，因此高效、快速的RNA提取方法成為一種關鍵技術。

RNA分子的種類和數量具有鮮明的時間性和空間性，研究中常常必須使用特定的研究材料。植物材料中所含有的多糖、蛋白質、脂肪和一些次生代謝物會在很大程度上干擾RNA的提取質量和回收效率。而植物種子的成分較其它植物組織更為復雜，種子中含有大量的多糖、儲藏蛋白、脂肪，多數還含有酚、酮、甙等次生代謝物，這給高質量RNA的提取造成了較大難度。目前種子RNA提取方法主要有纖維柱法?(Pramanik?SK,?Reynolds?TL,?Maclsaac?SA,?et?al?Rapid?and?efficient?purification?of?seed?messenger?RNA?without?phenol:?chloroform?extraction.?Seed?science?research,?1993,?3:137-139)、SDS法?(Hosein?F.?Isolation?of?high?quality?RNA?from?seeds?and?tubers?of?the?Mexican?yam?bean?(Pachyrhizus?erosus).?Plant?Molecular?Biology?Reporter,?2004,?19:65a-65e)、CTAB法?(溫小杰，張佳寅，王省芬等.?棉花組織總RNA的快速提取方法.?分子植物育種，2004,?2:147-150)、十二烷基肌氨酸鈉/鹽酸胍法?(Sharma?AD,?Gill?PK,?Singh?P.?RNA?isolation?from?plant?tissues?rich?in?polysaccharides.?Analytical?Biochemistry,?2003,?314:319-321)、高鹽法?(Suzuki?Y,?Kawazu?T,?Koyama?H.?RNA?isolation?from?siliques,?dry?seeds,?and?other?tissues?of?Arabidopsis?thaliana.?Biotechniques,?2004,?37:542-544)、尿素/LiCl法?(Tai?HH,?Pelletier?C,?Beardmore?T.?Total?RNA?isolation?from?Picea?mariana?dry?seed.?Plant?Molecular?Biology?Reporter,?2004,?22:93a-93e)?等。這些方法或是費用昂貴，或是操作步驟多、提取耗時長。

本發明以十二烷基肌氨酸鈉/鹽酸胍法為基礎，改進提取液組分，分別以番茄新鮮種子、番茄干種子、辣椒新鮮種子、辣椒干種子為材料，高效提取高質量的RNA，時間較短，獲得率較高。適用于以番茄為例的茄科類種子。

發明內容

本發明的目的是提供一種新的高效抽提茄科類種子RNA的方法，是以十二烷基肌氨酸鈉/鹽酸胍法為基礎，能夠有效降低所抽提RNA中酚類和蛋白質等雜質的含量，純度較好。為后期針對茄科類植物的種子進行更全面的分子生物學分析奠定了基礎。

本發明目的通過如下技術方案實現：

（1）?樣品前處理：茄科類植物的新鮮種子或干種子用質量百分比濃度為10~15%的次

氯酸鈉消毒10~15min（其中有效氯為3%）后，用滅菌水清洗3~4次，將種子切開，加入液氮充分研磨成粉狀；

（2）初次抽提：取研磨充分的樣品80~100mg，加入滅菌的提取液和苯酚各100~120ul，充分渦旋，在冰水混合物中冰浴10~20min，離心；

（3）二次抽提：離心后吸取上清液，按每毫升上清液添加500~600ul三氯甲烷/異戊醇混合液的比例在上清液中加入三氯甲烷/異戊醇混合液，充分渦旋，離心收集最上層的上清液，然后按每毫升上清液添加500~600ul苯酚/三氯甲烷混合液的比例在上清液中加入苯酚/三氯甲烷混合液，再抽提一次，離心，收集上清液；