[發(fā)明專利]一種CEA陽性腫瘤特異性樹突狀細(xì)胞疫苗的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310059166.6
• 申請日: 2013-02-26
• 公開（公告）號(hào): CN104001185A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 付建喜;葉永清;蘇國新
• 申請（專利權(quán)）人: 上海柯萊遜生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): A61K48/00
• 分類號(hào): A61K48/00;A61K39/00;A61P35/00;C12N15/861;C12N5/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域。具體涉及了一種腺病毒載體介導(dǎo)癌胚抗原CEA抗原肽基因轉(zhuǎn)染制備CEA陽性腫瘤特異性樹突狀細(xì)胞疫苗的方法。

背景技術(shù)

胃癌和大腸癌是目前我國發(fā)病率很高的惡性腫瘤，胃癌占消化道惡性腫瘤的第一位，大腸癌發(fā)病率已經(jīng)上升到第四位。目前大腸癌，胃癌首選的有效治療方法仍是手術(shù)切除，但切除率較低，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移較高。術(shù)后綜合治療以放療，化療為主，但毒副作用大，患者往往難以接受。因此，胃癌和大腸癌預(yù)后欠佳，需要尋找新的更有效的治療方法。

隨著科學(xué)的不斷進(jìn)展，腫瘤的生物治療異軍突起，已經(jīng)成了繼手術(shù)，放療，化療后的第四大腫瘤治療技術(shù)，在改善患者生存質(zhì)量，降低復(fù)發(fā)率方面的重要作用已經(jīng)得到越來越多的認(rèn)可和重視。樹突細(xì)胞(dendritic?cells,?DC)是人體內(nèi)功能最強(qiáng)大的專職抗原呈遞細(xì)胞(antigen?process?cells，APC)，能誘導(dǎo)出抗原特異性細(xì)胞毒T?淋巴細(xì)胞(cytotoxic?T?lymphocyte，CTL)?反應(yīng)，在人體抗腫瘤免疫中發(fā)揮著重要的作用。DC細(xì)胞表面的MHC分子可以和腫瘤抗原結(jié)合，然后遞呈給T細(xì)胞，誘導(dǎo)T細(xì)胞活化，激活初始免疫應(yīng)答，在體內(nèi)發(fā)揮免疫監(jiān)視功能。因此自從DC強(qiáng)大的遞呈抗原功能被發(fā)現(xiàn)以來，就得到了人們的廣泛關(guān)注，目前國內(nèi)外圍繞以DC為核心的抗腫瘤免疫治療研究積累了大量的經(jīng)驗(yàn)。不過盡管以DC為基礎(chǔ)的免疫治療副作用輕微，能誘導(dǎo)出一定的抗腫瘤免疫反應(yīng)，多數(shù)研究所獲得的臨床效果還是有限。

癌胚抗原（CEA）是一種廣為人知的廣譜腫瘤標(biāo)志物。最早是在1965年由加拿大學(xué)者Gold和Freedman首先從胎兒結(jié)腸及結(jié)腸癌的提取物中發(fā)現(xiàn)，在多種類型的腫瘤上都有表達(dá)。人們把有CEA表達(dá)的腫瘤稱為CEA陽性腫瘤，CEA陽性腫瘤包括90%以上的胃癌，腸癌，胰腺癌，70%以上的非小細(xì)胞肺癌等，目前臨床上常把CEA作為大腸癌和消化道惡性腫瘤的輔助診斷指標(biāo)。CEA在正常組織、癌組織和胚胎中表現(xiàn)出復(fù)雜的表達(dá)模式，尤其是CEA表現(xiàn)出選擇性的上皮細(xì)胞表達(dá)。盡管CEA在一些正常組織中也有微量存在，但它在腫瘤組織中的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常組織。因此CEA是一種比較理想的靶抗原。然而由于CEA免疫原性弱，往往不能有效激活機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對CEA的免疫應(yīng)答，故而人們一直尋求多種途徑增強(qiáng)CEA的免疫原性。

癌胚抗原（CEA）是一種廣為人知的廣譜腫瘤標(biāo)志物。最早是在1965年由加拿大學(xué)者Gold和Freedman首先從胎兒結(jié)腸及結(jié)腸癌的提取物中發(fā)現(xiàn)，在多種類型的腫瘤上都有表達(dá)。人們把有CEA表達(dá)的腫瘤稱為CEA陽性腫瘤，CEA陽性腫瘤包括90%以上的胃癌，腸癌，胰腺癌，70%以上的非小細(xì)胞肺癌等，目前臨床上常把CEA作為大腸癌和消化道惡性腫瘤的輔助診斷指標(biāo)。CEA在正常組織、癌組織和胚胎中表現(xiàn)出復(fù)雜的表達(dá)模式，尤其是CEA表現(xiàn)出選擇性的上皮細(xì)胞表達(dá)。盡管CEA在一些正常組織中也有微量存在，但它在腫瘤組織中的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常組織。因此CEA是一種比較理想的靶抗原。然而由于CEA免疫原性弱，往往不能有效激活機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對CEA的免疫應(yīng)答，故而人們一直尋求多種途徑增強(qiáng)CEA的免疫原性。

目前腫瘤的基因治療也已經(jīng)成了一個(gè)熱點(diǎn)。腺病毒是一種DNA雙鏈無包膜病毒，基因組為36kb，基因背景清楚，在美國應(yīng)用多年，證明對人體是無害的。腺病毒載體以其宿主范圍廣，轉(zhuǎn)染效率高，不整合到宿主基因組中，僅瞬時(shí)表達(dá)，安全性高，易制備高滴度腺病毒等優(yōu)點(diǎn)而成為人類基因治療中最理想的病毒載體之一。一般將E1或E3基因缺失的腺病毒載體稱為第一代腺病毒載體，E1基因缺失喪失復(fù)制能力，但可以在E1補(bǔ)償細(xì)胞如293細(xì)胞中復(fù)制。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)階段應(yīng)用常規(guī)方法所誘導(dǎo)的DC細(xì)胞受腫瘤免疫抗原性強(qiáng)度影響大，免疫激發(fā)力較弱等方面的不足。本發(fā)明提供了一種腺病毒載體介導(dǎo)癌胚抗原CEA抗原肽基因轉(zhuǎn)染制備DC細(xì)胞疫苗的方法，使獲得的CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗具有更強(qiáng)的免疫激發(fā)能力，并且不需要制備腫瘤抗原，讓DC疫苗的制備不再受腫瘤細(xì)胞來源較少，抗原蛋白成本較高的限制。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，設(shè)計(jì)一種一種CEA陽性腫瘤特異性DC細(xì)胞疫苗的制備方法，該方法由以下步驟組成：

a.構(gòu)建載有癌胚抗原CEA抗原肽基因的重組腺病毒AD-CEA；

b.分離和培養(yǎng)DC細(xì)胞；

c.采用重組腺病毒AD-CEA轉(zhuǎn)染DC細(xì)胞，獲得CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗AdCEA-DC。