[發明專利]一種CEA陽性腫瘤特異性樹突狀細胞疫苗的制備方法

無效

• 申請號: 201310059166.6
• 申請日: 2013-02-26
• 公開（公告）號: CN104001185A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發明（設計）人: 付建喜;葉永清;蘇國新
• 申請（專利權）人: 上海柯萊遜生物技術有限公司
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61K39/00;A61P35/00;C12N15/861;C12N5/10
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1.一種CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，其特征在于包括如下工藝步驟：

a.?構建載有癌胚抗原CEA抗原肽基因的重組腺病毒AD-CEA；

b.?分離和培養DC細胞；

c.?采用重組腺病毒AD-CEA轉染DC細胞，獲得CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗AdCEA-DC。

2.根據權利要求1所述的CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，其特征在于所述的步驟?(a)?包括如下工藝步驟：

a1：將載有癌胚抗原CEA抗原肽基因的穿梭質粒和腺病毒骨架質粒共轉染293細胞，培養至出毒，得到原代毒種；

a2：用原代毒種感染293細胞，待2-3天細胞病變后，進行濃縮純化，獲得擴增后的重組腺病毒AD-CEA。

3.根據權利要求1所述的CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，其特征在于所述的步驟?(b)?中的DC細胞包括下列細胞：外周血單個核細胞培養的DC細胞，骨髓來源的DC細胞，臍帶血來源的DC細胞。

4.根據權利要求1所述的CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，其特征在于所述的步驟?(c)?包括如下工藝步驟：

c1：采用步驟?(a)?中制備的重組腺病毒AD-CEA病毒液感染步驟?(b)?中制備的DC細胞；

c2：采用含有GM-GSF和IL-4的完全培養液，于37℃，5%CO2的培養箱中繼續培養步驟?(c1)?中感染后的DC細胞；

c3：到第5天，在步驟?(c2)?中培養的DC細胞中加入TNF-α，繼續培養3天，第8天獲得的CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗AdCEA-DC，光鏡下形態學鑒定，并用流式細胞儀檢測細胞表型CD1a，CD80，CD83，CD86，HLA-DR。

5.根據權利要求1所述的CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，其特征在于：步驟?(a)?中所述的重組腺病毒AD-CEA是Ad2或Ad5血清型的腺病毒，該病毒缺失E1區和E3區，并且在E1區位置插入了癌胚抗原CEA抗原肽基因表達盒，該表達盒依次包括：啟動子序列，癌胚抗原CEA抗原肽基因編碼序列，聚腺苷酸信號序列。

6.根據權利要求1所述的CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，其特征在于：步驟?(a)?中所述的癌胚抗原CEA抗原肽的堿基序列如SEQ?ID?NO:1所示。

7.根據權利要求1所述的CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，其特征在于：步驟?(c)?中獲得的CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗AdCEA-DC，是通過腺病毒為載體將癌胚抗原CEA抗原肽基因轉入DC細胞中獲得的，可以表達癌胚抗原CEA抗原肽基因。

8.根據權利要求1所述的CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，其特征在于：步驟?(c)?中用來感染DC的重組腺病毒AD-CEA的使用MOI值為50-1000。

9.根據權利要求1所述的CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，其特征在于：步驟?(c)?中獲得的CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗AdCEA-DC，CEA抗原肽基因陽性表達率在20%-100%。

10.根據權利要求1所述的CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，其特征在于：步驟?(c)?中獲得的CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗AdCEA-DC可誘導出對CEA表達陽性腫瘤細胞有特異性殺傷作用的CTL。