[發明專利]一種尿激酶原基因突變體及其制備方法

無效

• 申請號: 201310058677.6
• 申請日: 2013-02-25
• 公開（公告）號: CN103146727A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 陳永福;熊曉云
• 申請（專利權）人: 南昌市萬華生化藥業有限公司
• 主分類號: C12N15/58
• 分類號: C12N15/58;C12N15/10
• 代理公司: 南昌洪達專利事務所 36111
• 代理人: 劉凌峰

技術領域

本發明涉及生物工程領域，尤其涉及一種尿激酶原基因突變體及其制備方法。?

背景技術

?尿激酶原（pro-UK,單鏈尿激酶性纖溶酶原激活劑，scu-PA）是一種單鏈絲氨酸蛋白酶原，成熟蛋白分子由411個氨基酸殘基組成，分子量54KD。尿激酶原在纖溶酶、胰蛋白酶和激肽釋放酶等作用下，在158位賴氨酸和159位亮氨酸（Ile）之間發生斷裂，斷裂之后形成的A和B兩條肽鏈，兩條鏈通過第148位與第279位的半胱氨酸（Cys148-Cys279）之間形成的二硫鍵相互連在一起，形成高分子尿激酶（HMW-UK）。高分子尿激酶的分子量與尿激酶原相同。高分子尿激酶能在纖溶酶作用下進一步發生水解，在Lys135-Lys136之間產生斷裂，失去前面的135個氨基酸，形成低分子量尿激酶（LMW-UK）。尿激酶原、高分子量尿激酶和低分子量尿激酶均能激活纖維蛋白溶解酶原（plasminogen）,?使之成為纖維蛋白溶解酶（plasmin）。纖維蛋白溶解酶可以將血栓處的纖維蛋白和和其它血漿蛋白降解。因此，尿激酶原、高分子尿激酶和低分子尿激酶均能用于血栓治療。但是，作為溶解血栓的藥物，以尿激酶原最為安全，因為它在到達栓塞部位之前是沒有活性的，到達治療部位之后在原位發生降解，才生成能夠激活纖維蛋白溶解酶原活性的尿激酶。由于這個緣故，使用尿激酶原作為溶栓藥物時，可以通過一次性注射達到溶解血栓的用藥劑量，治療效果比較好；而尿激酶本身具有生物活性，能對給藥通路上的血管壁產生影響，使用時必須控制給藥速度，通過分步用藥，逐漸達到治療劑量。因此，當阻斷血管的栓塞較大時，尿激酶的治療效果不如尿激酶原好。?

尿激酶原是一種糖蛋白，蛋白質分子在體內合成之后需要進一步加工，在某些氨基酸殘基（糖基化位點）上增加糖鏈。但是，作為溶栓藥物，糖基化對尿激酶并不重要，在尿激酶原分子上增加糖鏈，既不能大幅提高它的生物活性，也不能有效降低它的分子在血液中被清除的速度。基于上述原因，工業化生產尿激酶原蛋白質，既可以采用真核細胞大規模培養技術，也可以采用基因工程細菌大規模發酵工藝。?

尿激酶原是一種真核生物蛋白質，其編碼基因使用的遺傳密碼與原核生物有所不同，存在許多對于大腸桿菌來說是稀有的密碼子。由于大腸桿菌中對應于這些稀有密碼子的轉移RNA豐度很低，蛋白質合成過程受到某些氨基酸供應的限制，故天然尿激酶原基因在基因重組大腸桿菌中的表達水平很低。若想采用微生物發酵技術大規模生產尿激酶原，必須采用的關鍵技術之一，就是優化基因中氨基酸的遺傳密碼，用大腸桿菌偏愛的密碼子替換動物基因慣用的密碼子。?

本發明分析了公開發表的人尿激酶原基因序列，發現若要在大腸桿菌中有效表達該基因，基因序列中有多達20個遺傳密碼需要替換。這些密碼子在基因序列中的位置分散，難以用基因定點突變等簡單操作將基因序列完全優化。?

發明內容

本發明的目的在于提供了一種尿激酶原基因突變體及其制備方法，它是適宜在大腸桿菌中表達的新型尿激酶原基因，實現了通過大腸桿菌發酵技術生產尿激酶原。?

本發明是這樣來實現的，一種尿激酶原基因突變體，其特征在于在保持蛋白質的氨基酸組成和序列不變的前提下，在基因序列的5’端增加了兩個核苷酸G和T，在序列的3’端增加了核酸內切酶Sal1的識別序列GTCGAC，其基因突變體的核苷酸序列為序列表1；突變基因序列包含一系列密碼子替換；密碼子代換的詳細資料如下：第34位亮氨酸的密碼子從CTA變為CTT，第64位異亮氨酸的密碼子從ATA變為ATC，第79位精氨酸的密碼子從CGA變為CGT，第107位組氨酸的密碼子從CAC被更換成CAT，第108位精氨酸的密碼子從AGA變為CGC，第123位精氨酸的密碼子從AGG變為CGC，第128、129、130位連續三個精氨酸的密碼子從CGG?CGA?AGG變換為CGC?CGT?CGC，第198位和199位兩個精氨酸的密碼子從AGG?AGG?變為CGC?CGT,第201位精氨酸的密碼子從CGG?變換成CGC，第243位精氨酸的密碼子從AGG變為CGT，第273位組氨酸的密碼子從CAC變為CAT，第287位精氨酸密碼由AGG變為CGC，第293位精氨酸密碼子從AGG變為CGT，第295位異亮氨酸的密碼子從ATA更換為ATT，第343位精氨酸的密碼子從CGG變為CGC，第411位精氨酸的密碼子從AGA變換成CGC。?