[發(fā)明專利]一種尿激酶原基因突變體及其制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310058677.6
• 申請日: 2013-02-25
• 公開（公告）號: CN103146727A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳永福;熊曉云
• 申請（專利權(quán)）人: 南昌市萬華生化藥業(yè)有限公司
• 主分類號: C12N15/58
• 分類號: C12N15/58;C12N15/10
• 代理公司: 南昌洪達(dá)專利事務(wù)所 36111
• 代理人: 劉凌峰

1.一種尿激酶原基因突變體，其特征在于在保持蛋白質(zhì)的氨基酸組成和序列不變的前提下，在基因序列的5’端增加了兩個核苷酸G和T，在序列的3’端增加了核酸內(nèi)切酶Sal1的識別序列GTCGAC，其基因突變體的核苷酸序列為序列表1；突變基因序列包含一系列密碼子替換；密碼子代換的詳細(xì)資料如下：第34位亮氨酸的密碼子從CTA變?yōu)镃TT，第64位異亮氨酸的密碼子從ATA變?yōu)锳TC，第79位精氨酸的密碼子從CGA變?yōu)镃GT，第107位組氨酸的密碼子從CAC被更換成CAT，第108位精氨酸的密碼子從AGA變?yōu)镃GC，第123位精氨酸的密碼子從AGG變?yōu)镃GC，第128、129、130位連續(xù)三個精氨酸的密碼子從CGG?CGA?AGG變換為CGC?CGT?CGC，第198位和199位兩個精氨酸的密碼子從AGG?AGG?變?yōu)镃GC?CGT,第201位精氨酸的密碼子從CGG?變換成CGC，第243位精氨酸的密碼子從AGG變?yōu)镃GT，第273位組氨酸的密碼子從CAC變?yōu)镃AT，第287位精氨酸密碼由AGG變?yōu)镃GC，第293位精氨酸密碼子從AGG變?yōu)镃GT，第295位異亮氨酸的密碼子從ATA更換為ATT，第343位精氨酸的密碼子從CGG變?yōu)镃GC，第411位精氨酸的密碼子從AGA變換成CGC。

2.如權(quán)利要求1所述的一種尿激酶原基因突變體的制備方法，其特征在于所述的制備方法包括以下步驟：

（1）合成單鏈核苷酸片段

???采用單鏈DNA片段合成方法，它按照尿激酶原基因突變體的序列設(shè)計，從基因5’端到3’端劃分為20個片段，分別進(jìn)行合成；設(shè)計出的20個合成片段，涵蓋尿激酶原基因全部411個氨基酸的編碼序列，合成基因5’?端起始于尿激酶原天然分子的首位氨基酸絲氨酸的密碼子AGC，其3’?端結(jié)束于翻譯終止密碼子TGA；為了便于進(jìn)一步基因操作，便于用特異的表達(dá)載體在大腸桿菌中生產(chǎn)出天然尿激酶原蛋白質(zhì)分子，借助基因兩端引物的合成，預(yù)先對合成基因的兩個末端做出適當(dāng)處理；在5’端增加了兩個核苷酸GT，為的是在把基因插入表達(dá)載體時能夠恢復(fù)蛋白酶Xa的識別位點第4個氨基酸精氨酸的編碼；同時，為便于將基因插入表達(dá)載體，在其3’端增加了一個核酸內(nèi)切酶識別位點GTCGAC；這20個合成片段的主要特點有兩個：第一，20個片段依基因序列按順序從頭至尾排列；第二，1、3、5····等奇數(shù)片段的核苷酸排列與基因正鏈相同，2、4、6····等偶數(shù)片段的核苷酸序列與基因的負(fù)鏈相同；第三，相鄰兩個片段有13-15個堿基互補，可以退火連接在一起；

（2）PCR產(chǎn)生雙鏈DNA片段

為了應(yīng)用PCR延伸技術(shù)獲得雙鏈DNA，這些片段的序列資料取自雙鏈DNA分子的兩條互補鏈；標(biāo)有奇數(shù)的片段的DNA序列，其核苷酸排列順序與mRNA的核苷酸排列完全相同；而標(biāo)有偶數(shù)的片段的DNA序列，其核苷酸序列與mRNA的核苷酸序列互補；為了退火的需要，相鄰兩個片段之間有13-15bp堿基的互補區(qū)，在拼接基因的時候，相鄰的兩個片段可以借助互補區(qū)相互搭在一起，形成局部雙鏈區(qū)，并通過PCR延伸反應(yīng)把其余的單鏈區(qū)轉(zhuǎn)換成雙鏈，通過片段之間反復(fù)退火與延伸，將各個片段整合在一起，獲得尿激酶原的全基因序列；采用單鏈DNA片段退火和PCR延伸的方法，將合成的單鏈DNA片段組裝成雙鏈DNA片段，單鏈片段1-4組裝成雙鏈片段A；單鏈片段5-8組裝成雙鏈片段B；9-12組裝成C;?13-16組裝成D；17-20組裝成E；

（3）拼接尿激酶原基因突變體的全序列

接種培養(yǎng)含有尿激酶原基因A,B,C,D,E片段的細(xì)菌克隆，提取質(zhì)粒DNA，分離A,B,C,D,E片段DNA；以這些DNA片段為材料，按照基因設(shè)計圖上各個片段的順序關(guān)系，采用相互退火和PCR延伸的方法，將A片段和B片段連接在一起，得到長度為500bp?的AB片段；將C片段和D片段擴增為長度500bp的CD片段；然后，在1.5%的瓊脂糖凝膠電泳上分離和回收上述AB片段和CD片段，并直接用作模板進(jìn)行退火和PCR延伸，將它們連接在一起，得到800bp的ABCD片段；最后，采用同樣的方法，將尾部的小片段E連接到大片段ABCD的3’端，得到1200bp的完整片段，完成全序列的拼接；?

（4）尿激酶原基因突變體序列測定和分析

在完成全基因DNA序列的拼接之后，利用事先合成的一對PCR引物，將全基因序列進(jìn)行了擴增，并把它克隆到pUC18載體上，提取重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行測序分析；對于序列分析中發(fā)現(xiàn)的錯誤堿基，采用定點突變的方法全部予以糾正，直至全基因序列完全符合設(shè)計要求為止。

3.如權(quán)利要求2所述的一種尿激酶原基因突變體的制備方法，其特征在于所述的退火和PCR延伸是逐步完成的，詳細(xì)操作步驟分述如下：第一步，通過相鄰片段退火和PCR延伸，將相鄰的兩個片段1和2、3和4、5和6、7和8、9和10、11和12、13和14、15和16、17和18、19和20，從長度約為70個堿基的單鏈DNA片段，轉(zhuǎn)換成長度約為140bp的雙鏈DNA片段；第二步，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離和回收上述片段，并以它們?yōu)槟０暹M(jìn)行下一輪PCR擴增，把四個原始合成片段，即片段1-?4,、5-8、9-12、13-16、17-?20，擴增成為250bp的大片段；同樣，用1.5%?瓊脂糖凝膠電泳分離和回收這些片段，并用鈍端連接的方法，把它們插入到pUC18載體的Sma1位點，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5alpha，獲得含有上述5個大片段的細(xì)菌克隆；從含有上述5個250bp片段的5組細(xì)克隆庫中個挑選6個克隆擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行測序分析；通過解析DNA序列測定資料，從經(jīng)過測序的5組克隆中，各挑選2個克隆，編號保存其DNA樣本和菌體。