[發明專利]重組蛋白PACAP38-NtA及其編碼基因與應用

有效

• 申請號: 201310057657.7
• 申請日: 2013-02-22
• 公開（公告）號: CN103145851A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 洪岸;吳陸生;陳小佳
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K1/22;C07K1/18;C12N15/62;C12N1/21;C12N15/70;C12P21/02;A61K38/17;A61K47/48;A61P27/02;C12R1/19
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運貞;陳燕嫻

1.一種重組蛋白PACAP38-NtA，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

2.編碼權利要求1所述的重組蛋白PACAP38-NtA的核苷酸序列如SEQ?IDNO.2所示。

3.一種表達重組蛋白PACAP38-NtA的菌株，其特征在于：是將權利要求2所述的核苷酸序列轉染到大腸桿菌（Escherichia?coli）BL21（DE3）得到。

4.根據權利要求3所述的表達重組蛋白PACAP38-NtA的菌株，其特征在于通過如下制備方法得到：

（1）重組原核表達載體pET-3c/PACAP38-NtA的構建

①設計PACAP38-NtA的基因序列，基因合成，得到了編碼重組蛋白PACAP38-NtA的基因；

②使用引物F1和引物R1對步驟①得到的編碼重組蛋白PACAP38-NtA的基因進行PCR擴增，得到Xba?I-PACAP38-NtA-BamH?I基因，該基因具有起始密碼子ATG和兩個終止密碼子TAA、TGA，以及C末端含有6個His標簽位點；

引物F1：5’-ATGCTCTAGAATGCACTCTGACGGTATCTTC-3’；

引物R1：5’-ATCGGGATCCTCATTAATGATGATGATGATGATGCGGGGTCGGCGGGGT-3’；

③將步驟②中獲得的PCR產物與18-T連接，得到重組克隆載體18-T/PACAP38-NtA；

④用Xba?I和BamHI雙酶切步驟③得到的18-T/PACAP38-NtA，得到具有突出粘性末端的PACAP38-NtA片段；用Xba?I和BamH?I雙酶切載體pET-3c，得到具有突出粘性末端的線性載體pET-3c；將具有突出粘性末端的PACAP38-NtA片段和具有突出粘性末端的線性載體pET-3c連接，得到重組載體pET-3c/PACAP38-NtA；

（2）重組菌株的獲得：將重組載體pET-3c/PACAP38-NtA轉染到大腸桿菌（Escherichia?coli）BL21（DE3），得到表達重組蛋白PACAP38-NtA的重組菌株。

5.根據權利要求4所述的表達重組蛋白PACAP38-NtA的菌株，其特征在于：步驟（1）②中所述的PCR擴增的條件為：95℃?5分鐘；95℃?30秒、63℃?30秒、72℃?40秒，30個循環；72℃延伸10分鐘。

6.權利要求3～5任一項所述的表達重組蛋白PACAP38-NtA的菌株的發酵方法，其特征在于包含如下步驟：

1）活化：將表達重組蛋白PACAP38-NtA的重組菌株進行活化；活化的培養基為含氨芐西林和氯霉素的LB液體培養基；活化的條件為37℃，180rpm振蕩培養8～10h；

2）種子液的制備：將活化后的表達重組蛋白PACAP38-NtA的重組菌株逐級放大至發酵罐培養所需的種子液；逐級放大的培養基為含氨芐西林和氯霉素的LB液體培養基；每一級培養的條件為37℃、180～200rpm培養10h～12h；

3）發酵罐發酵：將種子液按體積比1:10接種到發酵培養基中；發酵的初始條件為37℃、200rpm、通氣量3L、保持溶氧在30%～50%；菌體發酵1h后再加入甘油作為碳源，在細菌進入對數增長期時加入IPTG進行誘導表達，同時將轉速增大到600rpm，增大通氣量至6L，誘導4h后放罐，在誘導期間，保持轉速為600rpm，通氣量為6L，溶氧保持在30%～50%；發酵培養基的組成如下：每升中含蛋白胨20g、酵母提取物20g、NaCl?3.3g、KH₂PO₄?1g、K₂HPO₄?3.9g，pH?7.2～7.4，蒸餾水溶解定容，121℃滅菌20min。