[發明專利]一種大腸桿菌生物膜檢測方法-96孔半定量法

無效

• 申請號: 201310057447.8
• 申請日: 2013-02-06
• 公開（公告）號: CN103215339A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發明（設計）人: 喻華英;閆石磊
• 申請（專利權）人: 塔里木大學
• 主分類號: C12Q1/06
• 分類號: C12Q1/06;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及大腸桿菌生物膜檢測方法-96孔半定量法。

背景技術

細菌生物膜(Bacterial?biofilm，BF)是相對于單個分散的浮游狀態的細菌(planktonic?cells)生存形式而言的一種獨特的細菌生存形式。Costerton等將其定義為：附著于有生命或無生命物體的表面，被細菌分泌的胞外黏質包裹的，具有高度組織化的細胞群體結構。BF是細菌在表面生活時采取的一種生長方式，它是細菌的一種本能，某一菌株能否形成BF，是與其所處的環境密切相關的，如環境中的營養成分、溫度、滲透壓、pH、鐵離子濃度和氧化還原電位等因素，其中，營養成分對BF的形成具有重要作用。生物膜是附著在固體表面的微生物群體，這些細胞鑲嵌在多聚物的外表面，展現出許多表型的改變，當細菌受到各種壓力，如極端的營養缺乏或過剩，低pH值，高滲透壓，氧化，抗菌劑和抗生素等，大量的細菌為了對抗不利的環境，通過自身合成的水合多聚物粘附在固體表面，以同著的方式生長從而形成生物膜，這是細菌所具有的一種非常重要的環境適應機制。生物膜的形成涉及到幾個明顯的階段，包括：起始的附著、細胞與細胞之間的吸附與增殖、生物膜的成熟、及最后細菌的脫離過程等四個階段。

能形成生物膜相關感染的細菌，主要包括革蘭氏陽性的腸球菌、葡萄球菌、鏈球菌和革蘭氏陰性的大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌、變形桿菌、沙門氏菌和銅綠假單胞菌等。

生物膜與人類的生產生活關系非常密切，一方面它可以黏附雜質，清潔污水，可作為污水處理的優良載體；另一方面，致病細菌不僅可直接在人體組織及器官的表面形成生物膜，引起諸如牙周病、慢性支氣管炎、敗血病、肺部感染和心內膜炎等難治疾病，而且可在植入人體內的醫療裝置(如隱型眼鏡、人工關節和心臟人工瓣膜等)的表面形成生物膜，從而導致一系列的感染并發癥。據估計，大約65％的人類細菌性感染是由細菌生物膜引起的。由于生物膜有較強的耐藥性，難以控制，往往引起嚴重的感染生物膜的研究一直是微生物學、醫學、環境科學等領域中的熱點問題。

大腸桿菌能否形成生物膜與細菌粘附結構(P菌毛、1型菌毛、F9菌毛)、細菌毒性物質如溶血素、細胞壞死因子，細胞毒力因子、及鐵載體有關系。毒力因子在細胞粘附、殺傷宿主細胞及細菌所生存的環境因素中等方面密切相關。大腸桿菌能在口腔、尿道、生殖道、腸道等形成生物膜，引起反復感染。

目前對細菌生物膜形成能力的測定通常采用半定量的方法，其中包括試管法、微孔法、Robbin氏法和利用特異性抗體的western?blot檢測等方法。微孔法也為實驗室廣泛采用的方法，因其可較高通量的儀器檢測染色值而適用于大量細菌生物膜形成的比較和篩選。目前的半定量法具有可比性差，重復性低，不易觀察、不易操作等優點。

發明內容

本發明的目的在于提供一種大腸桿菌生物膜檢測方法-96孔半定量法，所述方法以大腸桿菌為實驗材料，通過將其復蘇、活化，常規培養至對數生長期、測定OD600、釋稀OD_600nm值至0.01、上96孔板、37℃培養、洗板、固定、染色、溶解、測定等步驟，得到大腸桿菌生物膜陽性。該方法具有可比性強，重復性高，易操作等優點。可用于大批量大腸桿菌生物膜的篩選工作。

為實現上述目的，本發明所采用以下方案：96孔半定量法。包括以下步驟：

(1)復蘇菌株：從-70℃冰箱中取出甘油保存菌株，待菌液在冰浴下溶解后，取100μL菌液接種于5mL?LB液體培養基中，于37℃過夜震蕩培養。

(2)固化菌株：將菌液接種于麥康凱固體培養基中。置于37℃恒溫培養箱內培養24h。

(3)菌株培養至對數生長期：從麥康凱培養基中挑取紅色單菌落，接種到新鮮的LB液體培養基，37℃恒溫振蕩培養16h。再按1∶100倍稀釋：取培養的菌液50μL于新鮮的5mL?LB試管液體培養基上，于37℃緩慢震蕩4.5h，保證細菌處于對數生長期。

(4)稀釋菌數：測OD_600nm，用滅菌的M9培養基將所測OD_600nm值稀釋至0.01。

(5)上96孔板：取200μL稀釋至0.01菌液加入96孔U型平底板中，用M9液體培養基作為空白對照。于37℃恒溫箱中分別培養8h，24h，32h，48h和72h。

(6)洗板：將培養好的96孔U型平底板從恒溫箱中取出，棄菌液。用1％PBS緩沖液洗三次，棄洗液，拍干。

(7)固定：將甲醇放入96孔U型平底板中固定15min，晾干。