[發(fā)明專(zhuān)利]一種大腸桿菌生物膜檢測(cè)方法-96孔半定量法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310057447.8
• 申請(qǐng)日: 2013-02-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103215339A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-07-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 喻華英;閆石磊
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 塔里木大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/06
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/06;C12R1/19
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種針對(duì)大腸桿菌生物膜檢測(cè)方法-96孔半定量法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)從-70℃冰箱中取出甘油保存菌株，待菌液在冰浴下溶解后，取100μL菌液接種于5mL?LB液體培養(yǎng)基中，于37℃過(guò)夜震蕩培養(yǎng)；

(2)將菌液接種于麥康凱固體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h；

(3)從麥康凱培養(yǎng)基中挑取紅色單菌落，接種到新鮮的LB液體培養(yǎng)基，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)16h；

(4)按1∶100倍稀釋?zhuān)喝∨囵B(yǎng)的菌液50μL于新鮮的5mL?LB試管液體培養(yǎng)基上，于37℃緩慢震蕩4.5h，保證細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；

(5)測(cè)OD_600nm(6)用滅菌的M9培養(yǎng)基將所測(cè)OD_600nm值稀釋至0.01；

(6)取200μL稀釋至0.01菌液加入96孔U型平底板中，用M9液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，于37℃恒溫箱中分別培養(yǎng)24-48h；

(7)將培養(yǎng)好的96孔U型平底板從恒溫箱中取出，棄菌液；

(8)用1％PBS緩沖液洗96孔U型平底板，重復(fù)三次，棄洗液，拍干；

(9)將甲醇放入96孔U型平底板中固定15min，倒出并晾干；

(10))將1％結(jié)晶紫溶液加入96孔U型平底板中，染色5min，自來(lái)水緩慢沖洗多次，晾干，觀察板底部有無(wú)生物膜形成；

(11)用33％的冰醋酸加于96孔U型平底板中，待細(xì)菌生物膜完全溶解后，用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀中測(cè)定OD_600nm，測(cè)定OD_600nm值減去空白對(duì)照孔的OD_600nm值大于等于0.12則可判定其為生物膜陽(yáng)性。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述結(jié)晶紫使用濃度為1％；LB培養(yǎng)基、5xM9培養(yǎng)基使用濃度為1x?M9；所用96孔板為3599；所用甲醇為分析醇。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述將甘油保存的菌株接種于LB培養(yǎng)基，37℃過(guò)夜震蕩培養(yǎng)后再接種于麥康凱固體培養(yǎng)基中，其目的是固定、活化細(xì)菌和獲得單菌落，保證實(shí)驗(yàn)菌體是單菌落。

4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述用滅菌的M9培養(yǎng)基將所測(cè)OD_600nm值稀釋至0.01；所用M9培養(yǎng)基作為大腸桿菌生物膜的培養(yǎng)基。

5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述96孔板37℃恒溫箱中分別培養(yǎng)8h，24h，32h，48h和72h，觀察生物膜的形成狀態(tài)，主要是觀察大腸桿菌在隨著培養(yǎng)時(shí)間的不同，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗后，生物膜形成能力的強(qiáng)弱；在37℃更接近大腸桿菌形成生物膜機(jī)體的環(huán)境溫度。

6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述所用的96孔板的U型進(jìn)行了特殊處理，更有利結(jié)合具有離子基團(tuán)或疏水位點(diǎn)的生物大分子或者其它介質(zhì)，有利于細(xì)菌粘附，有利生物膜的黏附。

7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述所用甲醇作為生物膜的固定液。

8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀中測(cè)定生物膜的OD為600nm，其測(cè)定OD_600nm值減去空白對(duì)照孔的OD_600nm值大于等于0.12則可判定其為陽(yáng)性。