[發明專利]一種苯丙氨酸定量檢測試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請號: 201310057261.2
• 申請日: 2013-02-22
• 公開（公告）號: CN103196897A
• 公開（公告）日: 2013-07-10
• 發明（設計）人: 劉賓;楊曉林;孫旭東;孫中鋒;李鵬聰;張鑫;李瑞娟
• 申請（專利權）人: 北京源德生物醫學工程有限公司
• 主分類號: G01N21/76
• 分類號: G01N21/76
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 馮瓊;姜義民

技術領域

本發明涉及疾病診斷技術領域，特別涉及一種苯丙氨酸定量檢測試劑盒以及使用該試劑盒進行苯丙氨酸定量檢測的方法。

背景技術

苯丙酮尿癥主要由肝臟內苯丙氨酸羥化酶或其輔助因子四氫生物蝶呤缺乏或活性降低引起苯丙氨酸不能被正常代謝為酪氨酸，導致大量的苯丙胺及其旁路代謝產物在體內堆積，對患者神經系統造成不可逆損傷，引起智力發育遲緩、膚色異常、小頭畸形、語言障礙、癲癇等癥狀的最常見先天性氨基酸代謝異常疾病。正常人正常攝入蛋白后，血液中苯丙氨酸水平一般為0.6~2mg/dL(36~120μmol/L)，而苯丙酮尿癥患者正常攝入蛋白后，由于病情嚴重程度不同，根據血液中苯丙氨酸含量可將苯丙酮尿癥分為經典苯丙酮尿癥(血液苯丙氨酸濃度超過20mg/dL或1200μmol/L)、非經典苯丙酮尿癥(血液中苯丙氨酸濃度在6~20mg/dL或600~1200μmol/L)和輕型HPA(血液中苯丙氨酸在2~6mg/dL或120~600μmol/L)。

世界范圍內苯丙酮尿癥的平均發病率為1∶12,000，我國自1985年至2006年期間，共對13,666,750位新生兒進行了苯丙酮尿癥篩查，共檢出苯丙酮尿癥患兒1,170例，新生兒苯丙酮尿癥的發病率為1:11,680。通過及時診斷，并采取有效治療方法，比如低苯丙氨酸飲食控制，能使苯丙酮尿癥患者保持正常生理和智力發育，防止損傷的發生，因此苯丙酮尿癥的早期準確診斷在苯丙酮尿癥治療中起決定性作用，我國衛生部也明確要求在全國范圍內對新生兒進行苯丙酮尿癥篩查。

臨床上，苯丙酮尿癥的診斷以及新生兒苯丙酮尿癥的篩查主要通過檢測血液苯丙氨酸的含量來進行，目前血液苯丙氨酸含量的檢測方法主要有細菌抑制法、苯丙氨酸脫氫酶定量法、化學熒光法，這些方法都存在檢測線性范圍窄、靈敏度低的缺點。

發明內容

針對上述現有技術所存在的缺陷，本發明要解決的技術問題為提供一種檢測線性范圍寬、靈敏度高的苯丙氨酸定量檢測試劑盒以及使用該定量檢測試劑盒進行苯丙氨酸定量檢測的方法。

具體地，本發明提供了一種苯丙氨酸的定量檢測試劑盒，包括苯丙氨酸脫氫酶、輔酶β-NAD、輔酶FMN、長鏈脂肪醛、FMN-NADH氧化還原酶、細菌熒光素酶、0.05mol/L?pH10.0的Gly-NaOH緩沖液、0.1mol/L?pH7.0的K₂HPO₄-KH₂PO₄緩沖液。

上述檢測試劑盒中，作為優選，所述長鏈脂肪醛為正葵醛。

在具體的實施例中，所述FMN-NADH氧化還原酶和細菌熒光素酶為sigma公司的含細菌熒光素酶的NAD(P)H:FMN-氧化還原酶，其貨號為L8507，其工作濃度為0.5～1.0mg/ml。。

作為優選，上述檢測試劑盒還包括BSA。

本發明還提供了一種苯丙氨酸的定量檢測方法，包括如下步驟：

（1）使用0.05mol/L?pH10.0的Gly-NaOH緩沖液配制苯丙氨酸脫氫酶溶液、輔酶β-NAD溶液，備用；

（2）向含苯丙氨酸的待測樣品中加入步驟（1）所配制的輔酶β-NAD溶液、苯丙氨酸脫氫酶溶液，使苯丙氨酸發生脫氫反應生成苯丙酮酸，同時輔酶β-NAD被還原為β-NADH；該步驟為苯丙氨酸的脫氫反應，其反應方程式如圖2所示；

（3）使用0.1mol/L?pH7.0的K₂HPO₄-KH₂PO₄緩沖液配制輔酶FMN溶液、長鏈脂肪醛溶液、FMN-NADH氧化還原酶溶液、細菌熒光素酶溶液，備用；

（4）向步驟（2）所得反應混合物中加入步驟（3）所配制的輔酶FMN溶液、長鏈脂肪醛溶液、FMN-NADH氧化還原酶溶液和細菌熒光素酶溶液進行發光反應，3-5min內測定相對發光強度，根據校準品苯丙氨酸濃度與相對發光強度之間的線性關系，計算出樣本中的苯丙氨酸含量；該步驟的發光反應過程中，β-NADH與輔酶FMN發生電子傳遞，并釋放出490nm的藍綠色光，該反應過程所涉及的反應方程式如圖3所示。

上述方法中，作為優選，所述苯丙氨酸脫氫酶在步驟（2）所述反應體系中的終濃度為10~50mIU/L。

作為優選，所述輔酶β-NAD在步驟（2）所述反應體系中的終濃度為0.5~3mmol/L。

作為優選，所述輔酶FMN在步驟（4）所述反應體系中的終濃度為2~10μmol/L。