[發明專利]一種合成的重組鴨β-防御素-2蛋白的重組酵母陽性轉化子的生產方法

有效

• 申請號: 201310056858.5
• 申請日: 2011-12-06
• 公開（公告）號: CN103205452A
• 公開（公告）日: 2013-07-17
• 發明（設計）人: 張輝華;韓小鳳;馬保華;畢英佐;馬靜云;謝青梅;李辰
• 申請（專利權）人: 佛山科學技術學院
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 佛山市永裕信專利代理有限公司 44206
• 代理人: 楊啟成

技術領域

本發明涉及一種動物生物醫藥工程領域的基因的生產方法。

背景技術

現代畜牧業飼用動物在具有高產性能的同時，對環境應激和病原愈加敏感。特別是在集約化飼養條件下，飼用動物面臨更多的應激和病原的侵襲。畜牧生產中迫切需要一種高效、無毒害、無殘留的免疫促進劑和生長促進劑，在提高飼用動物抗病力的同時，又能提高飼用動物的生產性能及動物產品的安全，以促進畜牧業的健康發展，降低畜牧生產對人類健康及生態環境的破壞。前人研究發現，防御素具有廣譜殺菌活性以及超強的抗微生物作用，且作用機理特殊，微生物不易產生抗性，對腫瘤細胞還有細胞毒性作用，同時也可以作為免疫增強劑用于調節動物機體免疫系統，給人們展現了一條開發理想促生長及免疫促進的新途徑。

由于動物體天然防御素含量低，直接提取遠不能滿足需要，且成本高、得率低、工序繁；化學合成可行但成本太高，應用受到局限；隨著基因工程技術的發展，通過基因重組技術生產防御素多肽，以滿足研究和生產的需要成為可能。目前，防御素的基因工程已是生物醫學領域研究的熱點。基于防御素的重要生理功能及其在生產實際中具有非常好的應用前景，我們進行了一種重組鴨β-防御素-2蛋白體外重組表達生產方法的發明研究。

發明內容

本發明的發明目的在于提供一種抗菌促生長活性，適合于在畜牧生產中進行應用，而且生產成本低、生產效率高的合成的重組鴨β-防御素-2蛋白的重組酵母陽性轉化子的生產方法。

本發明重組鴨β-防御素-2基因是這樣實現的，依次包括鴨β-防御素-2（AvBD2）基因核苷酸序列設計與體外合成、重組質粒pPICZα-A-AvBD2的構建過程、含鴨β-防御素-2（AvBD2）的酵母重組轉化子的篩選過程、含鴨β-防御素-2（AvBD2）的酵母重組轉化子體外誘導表達過程，

本發明的鴨β-防御素-2（AvBD2）基因核苷酸序列設計與體外合成過程是這樣實現的，

參照GenBank中注冊的鴨AvBD2基因cDNA基因序列，同時根據酵母密碼子偏好性對鴨AvBD2基因成熟肽段核苷酸序列進行改造，然后利用基因合成方法合成（送上海生工生物工程技術有限公司進行基因合成），改造后合成的鴨β-防御素-2（AvBD2）基因核苷酸序列如下：

GATATGTTTTTGTGTAGAATTGGTTCTTGTCATTTTGGTAGATGTCCAATTCATTTGGTTAGAGTTGGTTCCTGTTTTGGTTTTAGATCTTGTTGTAAGTCTCCATGGGATGTTTAA。

本發明的含有重組鴨β-防御素-2基因的重組質粒pPICZα-A-AvBD2是這樣實現的，

重組質粒pPICZα-A-AvBD2的構建過程依次是：

1、鴨β-防御素-2（AvBD2）基因上游引物、下游引物的設置過程：根據合成的鴨β-防御素-2（AvBD2）基因核苷酸序列經多重比較后設計而成，上游引物設計在該基因起始端，同時根據表達載體pPICZα-A上的酶切位點，上游引物設計時添加了Xho?I酶切位點及Kex2與Ste13蛋白酶裂解位點，在Xho?I酶切位點前加有3個保護性堿基TCT；下游引物設計在基因末端，并加上Not?I酶切位點，在Not?I酶切位點位點前加有4個保護性堿基GCTG，所設置的鴨β-防御素-2（AvBD2）基因上游引物、下游引物分別為，

鴨β-防御素-2（AvBD2）基因上游引物：

5’-TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGGATATGTTTTTGTGTAG-3’Xho?I酶切位點?，

鴨β-防御素-2（AvBD2）基因下游引物：

5’-GCTGGCGGCCGCTTAAACATCCCAT-3’?Not?I酶切位點?，