[發(fā)明專利]一種合成的重組鴨β-防御素-2蛋白的重組酵母陽性轉化子的生產(chǎn)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310056858.5
• 申請日: 2011-12-06
• 公開（公告）號: CN103205452A
• 公開（公告）日: 2013-07-17
• 發(fā)明（設計）人: 張輝華;韓小鳳;馬保華;畢英佐;馬靜云;謝青梅;李辰
• 申請（專利權）人: 佛山科學技術學院
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 佛山市永裕信專利代理有限公司 44206
• 代理人: 楊啟成

1.一種合成的重組鴨β-防御素-2蛋白的重組酵母陽性轉化子的生產(chǎn)方法，其特征在于，

（1）重組質粒的制備和線性化：挑取轉化入重組質粒pPICZα-A-AvBD2的Top?10陽性菌接種于25?mL含25μg/mL?Zeocin的低鹽液體LB培養(yǎng)基中，37℃，220?rpm振搖培養(yǎng)24?h，將菌液于4℃，5?000rpm離心10?min，沉淀細菌，然后用質粒DNA抽提試劑盒抽提質粒，用Sac?I酶將抽提的重組質粒pPICZα-A-AvBD2線性化，

（2）畢赤酵母電轉化感受態(tài)細胞的制備：接種畢赤酵母宿主菌X33單菌落至5mL?YPD培養(yǎng)基中，30℃過夜培養(yǎng)，YPD含1wt%酵母抽提物、2?wt?%蛋白胨、2?wt?%葡萄糖，然后接種0.1～0.5mL過夜培養(yǎng)菌液到500mL新鮮YPD培養(yǎng)液，30℃培養(yǎng)，使OD600nm達到1.2～1.3，4℃?3?000r/m離心5min，棄上清；依次以500mL、250mL冰浴滅菌水及20mL冰冷1mol/L山梨糖醇重懸菌體洗滌，4℃?3?000r/m離心5min，離心3次；最后將細胞重懸于1mL冰浴滅菌的1mol/L山梨糖醇，即為畢赤酵母感受態(tài)細胞，

（3）畢赤酵母的電擊轉化：取80μL準備好的畢赤酵母感受態(tài)細胞，與5～10μg線性化的重組質粒pPICZα-A-AvBD2混合，轉移到冰浴的0.2cm電轉杯中，冰浴15min，于2000-Y型基因導入儀進行電擊轉化，電脈沖參數(shù)為電壓1500V，電容量25μF，電阻200Ω，電擊后立即加入1mL冰浴的1mol/L山梨糖醇到電轉化小杯中，將小杯內懸液轉移到一個滅菌的15mL的試管中，將試管在30℃下孵育1～2小時，取10、25、50、100與200uL分別鋪到含有200μg/mL?Zeocin?YPDS平板上以篩選高拷貝轉化子，30℃孵化平板2~3d至出現(xiàn)乳白色的酵母轉化菌落即為含鴨β-防御素-2的酵母重組轉化子，Zeocin?YPDS包含1?wt?%酵母抽提物、2?wt?%蛋白胨、2?wt?%葡萄糖、1M山梨糖醇、20g瓊脂粉。