[發明專利]OPN關聯蛋白pro-MMP-9基因的克隆及表達

無效

• 申請號: 201310056149.7
• 申請日: 2013-02-22
• 公開（公告）號: CN104004738A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發明（設計）人: 陳愛萍;蔣晟;梁靜;顧傳虎;姚洛芫
• 申請（專利權）人: 南京優科制藥有限公司
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64;C12N15/70
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于基因克隆表達技術領域，具體涉及一種OPN下游關聯蛋白基質金屬蛋白酶9酶原基因的克隆及表達的方法。

背景技術

胰腺癌是一種惡性程度很高的腫瘤。在我國，胰腺癌發病率呈逐步上升趨勢，是導致人口死亡的十大惡性腫瘤之一，未經治療者一年生存率大約20%，5年生存率不到4%。侵襲（invasion）和轉移（metastasis）是目前胰腺癌患者治療失敗的主要原因。骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是一種具有多種功能分泌型鈣結合磷酸化糖蛋白。近年研究發現，OPN在胰腺癌腫瘤細胞中呈高表達，并與胰腺癌的侵襲和轉移密切相關。因此，對其作用機制及信號通路的研究也顯得極為重要。

基質金屬蛋白酶-9（matrix?metalloproteinases?9，MMP-9）是金屬蛋白酶家族的重要成員之一，具有多種生物學功能：降解基底膜和細胞外基質，激活生長因子，促進細胞遷移。多種文獻報道^{（1）（2）}，基質金屬蛋白酶-9在腫瘤細胞中高表達，與腫瘤遷移密切相關。基質金屬蛋白酶-9通常以酶原形式存在，從胞內分泌到胞外，當酶原激活后方具有生物學功能。而最近研究顯示^（3），在胰腺癌中，OPN可能通過激活MMP-9而促進胰腺癌的侵襲和轉移。因此，基質金屬蛋白酶-9酶原(pro-matrix?metalloproteinases?9,pro-MMP-9)的研究顯得非常關鍵。

基質金屬蛋白酶-9酶原作為分泌型蛋白，在細胞外作用，含量極少，從生物體中直接純化得率低，操作繁瑣，成本也高，不能滿足工業化生產的需要。

參考文獻：

1.Hema?Rangaswami,?Anuradha?Bulbule,?and?Gopal?C.?Kundu.???Nuclear?Factor-inducing?Kinase?Plays?a?Crucial?Role?in?Osteopontin-induced?MAPK/IκBα?Kinase-dependent?Nuclear?Factor?κB-mediated?Promatrix?Metalloproteinase-9?Activation.???(2004)?J.?Biol.?Chem.?279：38921–35

2.Durlik?M,?Gardian?K??Metalloproteinase?2?and?9?activity?in?the?development?of?pancreatic?cancer.??(2012)?Pol?Przegl?Chir.?84:377-82.

3.?Collins?AL,?Rock?J,?Malhotra?L,?Frankel?WL,?Bloomston?M.?Osteopontin?expression?is?associated?with?improved?survival?in?patients?with?pancreatic?adenocarcinoma.?（2012）Ann?Surg?Oncol.?19:2673-8.

發明內容

本發明提供一種克隆、表達并分離純化OPN關聯蛋白基質金屬蛋白酶-9酶原（pro-MMP-9）蛋白質的方法，該方法包含：重組克隆載體TA-pro-MMP-9的構建、重組表達質粒pET-28a(+)-pro-MMP-9的構建和pro-MMP-9蛋白的誘導表達與鑒定。

進一步地，所述的基質金屬蛋白酶-9酶原的克隆、表達與蛋白純化方法中，重組克隆載體TA-pro-MMP-9的構建具體分為以下步驟：

1）.pro-MMP-9的引物設計：

以pET28a(+)-pro-MMP-9為模板，通過拼接PCR擴增pro-MMP-9，設計出4條引物pro-MMP-9p1、pro-MMP-9p2、pro-MMP-9p1-G-3’、?pro-MMP-9p2-G-5’，

上游引物pro-MMP-9p1含有內切酶位點Nde?I，下游引物pro-MMP-9p2含有內切酶位點Hind?III，

pro-MMP-9p1：5’-CGCATATGGCCATGGTGTACTGAG-3’???

pro-MMP-9p1-G-3’：5’-GTATCATAATGCTCCGGATACATTAGA-3’

pro-MMP-9p2-G-5’：5’-AGCCTGATGAAACTCGCAATTCTGTA-3’?