[發明專利]OPN關聯蛋白pro-MMP-9基因的克隆及表達

無效

• 申請號: 201310056149.7
• 申請日: 2013-02-22
• 公開（公告）號: CN104004738A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發明（設計）人: 陳愛萍;蔣晟;梁靜;顧傳虎;姚洛芫
• 申請（專利權）人: 南京優科制藥有限公司
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64;C12N15/70
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種OPN關聯蛋白基質金屬蛋白酶-9酶原的克隆、表達與蛋白純化方法，其特征在于，該方法包含：重組克隆載體TA-pro-MMP-9的構建、重組表達質粒pET-28a(+)-pro-MMP-9的構建和pro-MMP-9蛋白的誘導表達與鑒定。

2.根據權利要求1所述的基質金屬蛋白酶-9酶原的克隆、表達與蛋白純化方法，其特征在于，重組克隆載體TA-pro-MMP-9的構建具體分為以下步驟：

1）.pro-MMP-9的引物設計：

以pET28a(+)-pro-MMP-9為模板，通過拼接PCR擴增pro-MMP-9，設計出4條引物pro-MMP-9p1、pro-MMP-9p2、pro-MMP-9p1-G-3’、?pro-MMP-9p2-G-5’，

上游引物pro-MMP-9p1含有內切酶位點Nde?I，下游引物pro-MMP-9p2含有內切酶位點Hind?III，

pro-MMP-9p1：5’-CGCATATGGCCATGGTGTACTGAG-3’?

pro-MMP-9p1-G-3’：5’-GTATCATAATGCTCCGGATACATTAGA-3’

pro-MMP-9p2-G-5’：5’-AGCCTGATGAAACTCGCAATTCTGTA-3’???

?pro-MMP-9p2：5’-CGAAGCTTTGCGATGATAGATGTCACAC-3’；

2）.拼接PCR擴增pro-MMP-9基因片段

以pET28a(+)-pro-MMP-9為模板，通過拼接PCR擴增pro-MMP-9基因片段，先擴增Nde?I?與pro-MMP-9基因第66堿基中間的片段和pro-MMP-9基因第54-285位堿基序列，上述PCR產物用凝膠電泳，切膠后用膠回收試劑盒回收目的片段，再拼接PCR擴增Nde?I-mE7序列；

3）.TA克隆連接與轉化

取pMD18-T載體，加入延伸過A的pro-MMP-9片段，再加入連接緩沖液，連接；

將上述TA連接產物轉移到DH5α感受態細胞中轉化，即得TA陽性克隆。

3.根據權利要求1所述的基質金屬蛋白酶-9酶原的克隆、表達與蛋白純化方法，其特征在于，重組表達質粒pET-28a(+)-pro-MMP-9的構建具體分為以下步驟：

1）.酶切與回收目標片段：pro-MMP-9基因序列中有EcoR?I酶切位點，用EcoR?I/Hind?III雙酶切TA-?pro-MMP-9及pET-28a(+)質粒，然后回收目標片段；

2）.T4?DNA連接酶連接及轉化：在連接體系中連接過夜，然后將連接產物轉入DH5α感受態，培養過夜即得陽性克隆。

4.根據權利要求1所述的基質金屬蛋白酶-9酶原的克隆、表達與蛋白純化方法，其特征在于，pro-MMP-9蛋白的誘導表達與鑒定具體分為以下步驟：

1）.重組質粒轉化大腸桿菌：將上述鑒定為陽性的重組質粒pET-28a(+)-pro-MMP-9轉入感受態Rosetta，涂布于LB－Kan⁺平板上，培養過夜；

2）.IPTG誘導蛋白表達：挑單克隆于LB－Kan⁺中，培養過夜，然后接過夜菌于LB－Kan⁺中，繼續培養，然后加入IPTG誘導蛋白表達。

5.根據權利要求1～4?中任一項所述的基質金屬蛋白酶-9酶原的克隆、表達與蛋白純化方法，其特征在于，所述的方法中還包括pro-MMP-9蛋白的純化和鑒定：

1）.細菌蛋白表達形式的分析：-80℃凍存菌體:加入細菌裂解液，超聲破菌后離心，包涵體沉淀在底部，分別取上清、包涵體做SDS-PAGE，結果顯示pro-MMP-9蛋白主要存在于包涵體中；

2）.pro-MMP-9蛋白的純化：超聲破菌后，離心棄上清，沉淀超聲洗滌，將溶解有包涵體的溶液離心，取上清上樣至預先平衡好的鎳柱，分別用溶液洗滌10個柱床體積，再用洗脫緩沖液洗脫，收集蛋白液，充分透析，離心取上清液，收獲的蛋白用SDS-PAGE進行純度分析；

3）.pro-MMP-9蛋白的鑒定：SDS-PAGE電泳結束后取下凝膠，電轉到硝酸纖維素膜上，取膜，于室溫用5%脫脂奶粉封閉，加入鼠抗人pro-MMP-9抗體，室溫孵育，用PBST洗膜，加入羊抗鼠抗體室溫孵育，再用PBST洗膜，加入底物液顯色，在暗室內顯影、定影，即得目標條帶。