[發明專利]一種亞洲Ⅰ型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測方法及其試劑盒和應用

有效

• 申請號: 201310055748.7
• 申請日: 2013-01-17
• 公開（公告）號: CN103091270A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 馮霞;馬軍武;周廣青;楊亞民
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N33/569;G01N33/544;G01N33/535
• 代理公司: 北京中恒高博知識產權代理有限公司 11249
• 代理人: 夏晏平

技術領域

本發明涉及一種亞洲Ⅰ型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測方法及其試劑盒和應用。

背景技術

口蹄疫（foot?and?mouth?disease,?FMD）是豬、牛、羊等主要家畜和其它偶蹄動物共患的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，易感動物達70多種。臨床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮膚發生水皰性疹。該病傳播途徑多、速度快，曾多次在世界范圍內暴發流行，造成巨大政治、經濟損失。世界動物衛生組織（OIE）將其列為必須申報的傳染病，我國也將其列為一類動物傳染病之首。

口蹄疫病毒(foot?and?mouth?disease?virus,?FMDV)屬于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒屬，有七個血清型：O型、A型、亞洲Ⅰ型、C型以及南非1、2、3型。各血清型之間沒有交叉保護?，F階段我國主要流行O型、A型和亞洲Ⅰ型。

疫苗接種是預防、控制口蹄疫的有效手段之一。在我國，口蹄疫滅活疫苗使用最為廣泛；為確保它安全有效，對其質量進行嚴格的控制極為必要。目前，國際上通用的疫苗效力檢測方法是本動物攻毒保護試驗，或采用PD₅₀測定法（歐洲）：即用疫苗50%動物保護劑量(?PD₅₀)來評價疫苗免疫效果，常規疫苗需至少達到3個PD₅₀，緊急接種疫苗需至少達到6個PD₅₀；或采用（PGP）測定法（南美）：即用疫苗保護百分率（PGP）來評價疫苗免疫效果，PGP達到75%以上，該疫苗合格，PGP為62.5%～68.8%，需要進行重復檢驗，PGP小于62%，該疫苗不合格。本動物攻毒保護試驗的動物必須是來自無口蹄疫地區、無口蹄疫病毒中和抗體的非疫苗免疫本動物。由于我國采取強制免疫手段控制口蹄疫的流行和暴發，所以篩選試驗動物相當困難；另外，這種方法的成本高、周期長、重復性較差，且需要高安全動物舍，不易操作。

為此，研究者開展了多種檢驗方法的研究，嘗試替代本動物攻毒保護試驗。這些研究主要分為三類：血清學替代法、試驗動物替代法和疫苗抗原定量法。

口蹄疫血清學效力檢測替代方法是通過檢測疫苗免疫后的抗體滴度水平來評價疫苗免疫效力，主要包括病毒中和試驗和液相阻斷ELISA試驗。1968年，Stellman等提出了用中和抗體滴度分析疫苗效力的統計學方法；到1976年，Pay等根據中和抗體滴度和疫苗效力的關系建立了疫苗的抗原劑量、中和抗體滴度和保護率的相關公式。馬軍武等通過液相阻斷ELISA檢測疫苗免疫抗體與攻毒保護分析確定了牛、羊、豬等口蹄疫免疫抗體與攻毒保護的關系。疫苗免疫血清抗體效價檢測須用非口蹄疫疫苗免疫動物，無法從根本上取代本動物的使用，動物的選擇仍存在困難。

試驗動物替代法是用試驗動物（如小鼠、豚鼠等）代替本動物，進行疫苗效力檢驗。研究發現，用豚鼠進行?？谔阋邷缁钜呙绲男Яυ囼灒c本動物效力檢驗的?PD₅₀之間有較好的相關性?(Eissner等1976;?Terpstra等1976)，?也可用小鼠或BALB/c小鼠替代牛間接評價了口蹄疫滅活疫苗的效力（Sutmoller等?1980；DusSantos等2000）。替代性試驗動物適合規模養殖，均一性容易控制，試驗動物與本動物攻毒后的PD₅₀呈一定的正相關關系，但替代性試驗動物的與本動物的免疫反應有一定差別，而且替代性試驗動物人工感染病毒時使用的是試驗株，與天然感染在株系和感染途經上存在區別。

口蹄疫病毒在蔗糖密度梯度離心時，根據沉降系數不同，可以分為完整病毒粒子（146S或140S）、空衣殼（76S）、病毒感染相關肽（45S）、12?S蛋白亞單位（12S）。研究發現，完整病毒粒子（146S或140S）是口蹄疫滅活疫苗中誘導動物機體產生保護性免疫應答的主要成分，因此疫苗中完整病毒粒子含量與疫苗的免疫保護效力具有明顯相關性。FMD疫苗抗原定量的各種方法也是據此研發的，主要包括蔗糖密度梯度離心法、單抗夾心ELISA法和尺寸排阻層析法。

1971年，Fayet等建立了用紫外光定量檢測蔗糖梯度中口蹄疫完整病毒粒子（146S或140S）的方法；隨后，Barteling?and?Meloen（1974）和Doel等對其進一步完善，并于1982年向OIE正式推薦。在此后的三十多年中，該方法一直作為口蹄疫疫苗抗原定量的經典方法被世界各國的口蹄疫疫苗研究者和供應商廣泛使用。但這種方法也有其缺點：操作復雜、儀器昂貴、重復性較差、不適合大量樣品檢測，還不能區分血清型。