[發(fā)明專利]一種亞洲Ⅰ型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測方法及其試劑盒和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310055748.7
• 申請日: 2013-01-17
• 公開（公告）號: CN103091270A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馮霞;馬軍武;周廣青;楊亞民
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N33/569;G01N33/544;G01N33/535
• 代理公司: 北京中恒高博知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11249
• 代理人: 夏晏平

1.一種亞洲Ⅰ型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）儲備亞洲Ⅰ型口蹄疫標(biāo)準(zhǔn)對照抗原；

2）純化定量亞洲Ⅰ型口蹄疫標(biāo)準(zhǔn)對照抗原146S；

3）建立亞洲Ⅰ型口蹄疫間接夾心ELISA方法；

4）繪制標(biāo)準(zhǔn)對照抗原標(biāo)準(zhǔn)曲線；

5）計(jì)算被檢樣品146S?抗原含量；

6）檢測敏感性和特異性。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種亞洲Ⅰ型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測方法，其特征在于，所述步驟1）中，對亞洲Ⅰ型口蹄疫標(biāo)準(zhǔn)對照抗原，一部分按5mL/瓶，置于-70℃儲備，此部分僅解凍一次，用于ELISA試驗(yàn)；另一部分按3×100?mL，置于-70℃儲備，此部分僅解凍一次，分三次用于146S抗原純化定量。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種亞洲Ⅰ型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測方法，其特征在于，所述步驟2）中，是利用蔗糖密度梯度法，梯度濃度為45%、35%、25%、15%，純化亞洲Ⅰ型口蹄疫標(biāo)準(zhǔn)對照抗原，三次測得146S抗原含量的平均值為1.74μg/ml。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種亞洲Ⅰ型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測方法，其特征在于，所述步驟3）中，建立亞洲Ⅰ型口蹄疫間接夾心ELISA方法的過程具體如下：

a）包被ELISA板：用pH?9.6的碳酸鹽包被緩沖液稀釋口蹄疫亞洲Ⅰ型兔抗血清至工作濃度，工作濃度為1:1000，即將1μl口蹄疫亞洲Ⅰ型兔抗血清加入1000μl碳酸鹽包被緩沖液中，混勻，每孔加50μl于底部，震蕩2-3分鐘后用封板膜封板或置濕盒中室溫過夜；

b）洗滌ELISA板：揭掉封板膜，棄去ELISA板中液體，每孔加滿洗滌液，洗滌液為0.01M，?pH?7.4的磷酸鹽吐溫緩沖液，1×PBST，靜置30秒后棄去液體，重復(fù)4次，拍干；

c）加樣：用1×PBST將對照抗原和被檢抗原從1:2，即50μl抗原加50μl?PBST，開始做2倍連續(xù)稀釋至1:256，每孔加50μl，37℃，溫育1小時(shí)，用PBST洗滌ELISA板4次，拍干；

d）加二抗：用豚鼠抗血清稀釋液稀釋口蹄疫亞洲Ⅰ型豚鼠抗血清至工作濃度，工作濃度為1:1000，即將1μl口蹄疫亞洲Ⅰ型豚鼠抗血清加入1000μl豚鼠抗血清稀釋液中，豚鼠抗血清稀釋液為含10%正常牛血清，5%健康兔血清的PBST，每孔加50μl，封板，37℃，溫育1小時(shí)后用PBST洗滌ELISA板4次，拍干；

e）加酶：用1×PBST稀釋兔抗豚鼠-辣根過氧化物酶結(jié)合物至工作濃度，工作濃度為1:500，即將1μl兔抗豚鼠-辣根過氧化物酶結(jié)合物加入1000μl?PBST中，每孔加50μl，37℃溫育1小時(shí)后用PBST洗滌ELISA板4次，拍干；

f）顯色：每孔加50μl底物溶液，37℃溫育15分鐘，所述底物溶液為20mmol/L鄰苯二胺OPD，0.05M檸檬酸磷酸鹽緩沖液，0.015%H₂O₂；

g）終止：每孔再加50?μl?終止液終止反應(yīng)，所述終止溶液為濃度為1.25%的H₂SO₄；

h）測定：在490nm?波長下讀取光吸收值。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種亞洲Ⅰ型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測方法，其特征在于，所述步驟4）中，是以標(biāo)準(zhǔn)對照抗原的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種亞洲Ⅰ型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測方法，其特征在于，所述步驟5）中，是以樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，得到樣品的實(shí)際濃度；

或以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，得到樣品的實(shí)際濃度。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種亞洲Ⅰ型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測方法，其特征在于，所述步驟6）中，是將亞洲Ⅰ型口蹄疫146S抗原作系列稀釋，用標(biāo)準(zhǔn)對照抗原的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式的最小抗原含量，將待測口蹄疫抗原作為被檢抗原時(shí)，檢測反應(yīng)OD值小于標(biāo)準(zhǔn)對照抗原的敏感性檢測值。