[發(fā)明專利]成人多能祖細(xì)胞的培養(yǎng)基以及采用成人多能祖細(xì)胞的培養(yǎng)基培養(yǎng)成人多能祖細(xì)胞的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310054058.X
• 申請日: 2013-02-20
• 公開（公告）號: CN103409366A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 范時洋
• 申請（專利權(quán)）人: 潘駿
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074
• 代理公司: 杭州斯可睿專利事務(wù)所有限公司 33241
• 代理人: 鄭書利

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及干細(xì)胞種子細(xì)胞的研究，尤其是成人多能祖細(xì)胞的培養(yǎng)基以及采用成人多能祖細(xì)胞的培養(yǎng)基培養(yǎng)成人多能祖細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

成人多能祖細(xì)胞(multipotent?adult?progenitor?cells，簡稱MAPC)是2002年美國明尼蘇達(dá)州州立大學(xué)干細(xì)胞研究所的科學(xué)家們在骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一種新的干細(xì)胞亞型，它最初是從人骨髓中純化分離出來，后陸續(xù)有科學(xué)家從身體其他部位，如脂肪、滑膜等組織也分離出MAPC，證明MAPC是一種分布廣泛干細(xì)胞。MAPC具有比間充質(zhì)干細(xì)胞更強(qiáng)的分化潛能和擴(kuò)增能力，可連續(xù)擴(kuò)增超過80代(最高達(dá)120代)不出現(xiàn)衰老，可分化成內(nèi)、中、外三胚層細(xì)胞。它不表達(dá)CD34、CD44、CD45、c-Kit和MHCⅠ、Ⅱ；能夠表達(dá)CD13和特殊時期抗原1(SSEA-1)，Oct-4、SSEA-1多能性基因；端粒酶活性穩(wěn)定，生物性狀不會隨著傳代次數(shù)增加而改變。但是，關(guān)于MAPC尚存在許多爭議，有人認(rèn)為它是基質(zhì)干細(xì)胞中的一個亞型，由于其數(shù)量太少而往往被人們忽略；也有人認(rèn)為它是一種類似胚胎外內(nèi)皮細(xì)胞的干細(xì)胞，完全不同于基質(zhì)干細(xì)胞，只不過它往往與基質(zhì)干細(xì)胞出現(xiàn)在同一部位而被誤以為同一種細(xì)胞。存在這些爭議是因?yàn)槟壳芭囵B(yǎng)MAPC技術(shù)還不成熟，培養(yǎng)方法繁多，缺乏一種公認(rèn)的培養(yǎng)MAPC的標(biāo)準(zhǔn)方法，而且培養(yǎng)高純度MAPC至少需3個月時間（僅用貼壁傳代培養(yǎng)方法，不采用免疫微磁珠分選）。

發(fā)明內(nèi)容

?本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種培養(yǎng)基組細(xì)胞生長更好、純度更高的成人多能祖細(xì)胞的培養(yǎng)。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題還包括提供一種培養(yǎng)時間更短的培養(yǎng)成人多能祖細(xì)胞的方法。

為此，本發(fā)明提供的成人多能祖細(xì)胞的培養(yǎng)基，包括560ml低糖DMEM、400mlMCDB-201、20ml胎牛血清、20ml雙抗青霉素和鏈霉素、10ug胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒（1×）、0.039mg地塞米松、25.6mg?2-磷酸抗壞血酸、1ug重組人表皮生長因子、1ug重組人血小板衍化生長因子BB?和1ug白血病抑制因子。

本發(fā)明還提供了采用上述培養(yǎng)基培養(yǎng)成人多能祖細(xì)胞的方法，包括A、臨床常規(guī)抽取骨髓5ml，采用低分子肝素鈉0.5ml抗凝；B、加入10ml淋巴細(xì)胞分離液中，以2500r/min密度梯度離心，收集中間灰色單核細(xì)胞層；C、加入預(yù)先放好5ml培養(yǎng)基的25?cm²培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO₂，孵箱中進(jìn)行骨髓單核細(xì)胞培養(yǎng)；D、培養(yǎng)2?天后換液，吸管吸除原培養(yǎng)基及懸浮細(xì)胞，然后PBS洗滌，加入新培養(yǎng)基5ml，繼續(xù)37℃，5%CO₂，孵箱中培養(yǎng)；E、以后每2～3天換液1次，直至30日內(nèi)倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞長至70%融合時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)；F、待細(xì)胞數(shù)量增至10⁷時，進(jìn)行CD45、GlyA免疫微磁珠分選去除CD45、GlyA陽性雜質(zhì)細(xì)胞純化MAPC。

在本發(fā)明中，采用專利技術(shù)的培養(yǎng)基組細(xì)胞明顯生長好，純度高。而且本發(fā)明提供的培養(yǎng)方法中通過CD45、GlyA免疫微磁珠分選去除CD45、GlyA陽性雜質(zhì)細(xì)胞純化MAPC，大大地提高了MAPC純化效率。在一個月內(nèi)就可以分離出高純度的MAPC，這樣明顯縮短了MAPC的培養(yǎng)時間，為干細(xì)胞種子細(xì)胞的研究帶來了便利。

說明書附圖

圖1為倒置顯微鏡下觀察第2代CD45、GlyA陰性MAPC?(×200)；

圖2為流式細(xì)胞檢測MAPC表達(dá)Oct-4、SSEA-1基因圖表；

圖3為熒光顯微鏡下檢測MAPC細(xì)胞表面標(biāo)志物Oct-4；

圖4為熒光顯微鏡下檢測MAPC細(xì)胞表面標(biāo)志物SSEA-1；

圖5為磁珠分選前倒置顯微鏡下普通培養(yǎng)基（15%胎牛血清）培養(yǎng)的MAPC第二代細(xì)胞?(200×)；

圖6為磁珠分選前倒置顯微鏡下本發(fā)明提供的培養(yǎng)基培養(yǎng)的MAPC第二代細(xì)胞?(200×)。

具體實(shí)施方式