[發明專利]一種快速提取荷花花瓣總RNA的方法

無效

• 申請號: 201310053848.6
• 申請日: 2013-02-20
• 公開（公告）號: CN103993003A
• 公開（公告）日: 2014-08-20
• 發明（設計）人: 王坤;鄧嬌;楊平仿
• 申請（專利權）人: 中國科學院武漢植物園
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 黃瑞棠

技術領域

本發明涉及分子生物學領域中提取總RNA（Ribonucleic?Acid，核糖核酸）的方法，尤其涉及一種快速提取荷花花瓣總RNA的方法；具體地說，是以一種次級代謝產物含量高的荷花花瓣為材料，快速、經濟和有效地提取高質量的總RNA的方法。

背景技術

荷花（Nelumbo?nucifera），又稱蓮花，水芙蓉等，屬睡蓮科多年生水生草本花卉。荷花在我國已有近3000年的栽培歷史，是一種集觀賞、食用和藥用于一身的重要經濟作物。目前對荷花在分子生物學方面的研究還很缺乏，主要集中于分子標記研究品種多態性，一些功能基因的克隆等方面。目前，迫切需要一種有效地提取荷花花瓣的總RNA的方法，為深層地研究與花的發育、花的香氣形成、花瓣中與次級代謝物合成以及荷花感光感溫等相關的功能基因的研究奠定基礎，進而用于培育荷花新品種。

商業化的Trizol（試劑盒）雖然能簡單快速地提取植物總RNA，但是無法有效地提取荷花花瓣的總RNA，分析可能是由于RNA被多糖多酚物質吸附不能得到有效的沉淀所致。有報道利用改良的CTAB-LiCl法提取荷花花瓣的總RNA（楊峰，李創等，2009）,?但是所用試劑繁多，而且耗時也很長，增大了提取過程中RNA降解的可能性，實際使用效果欠佳。雖然快速提取植物總RNA的試劑盒采用吸附核酸的樹脂或膜，但經實踐證明，依然不能解決上述問題，同時存在步驟多和效率低的問題。因此，迫切需要一種簡單快速且經濟的提取荷花花瓣總RNA的方法以便用于后續的分子生物學實驗的研究。

發明內容

本發明的目的就在于克服現有技術存在的缺點和不足，提供一種快速提取荷花花瓣總RNA的方法。

本發明的目的是這樣實現的：

包括提取RNA用具的處理、試劑的配置以及提取的具體步驟。

具體地說：

1、提取RNA用具的處理和試劑的配置

研缽、研杵和藥勺用紙包好置于160?^oC烘箱烘烤6個小時，槍頭和1.5ml

的離心管用的是RNase?free的Axygen公司產品（美國）；所有用到水配制的試劑都是用DEPC處理水（即0.1%的DEPC水37?^oC處理12小時后，再經121^oC高溫滅菌20min備用）。

2、具體步驟

①稱取0.2g荷花花瓣于液氮預冷的研缽中迅速充分地研磨成粉末狀；

②將粉末狀樣品轉入1.5mL?RNase?free的離心管中，加入1mL?65^oC預熱的細胞裂解液，混勻后繼續65^oC溫育10min，期間搖勻2～3次；?

③加入300μL的乙酸鉀溶液，上下溫和顛倒混勻15～20次，室溫靜置3～5min；

④4^oC，12000rpm，離心5min，取上清于一新的離心管中；

⑤加入300μL氯仿：異戊醇=24：1（V：V），震蕩15s，4^oC，12000rpm，離心30s使分層，取上層水相于一新的離心管中，重復此步驟1～2次；

⑥加入與上層水相等體積的-20^oC預冷的異丙醇，置于-20^oC冰箱30min；

⑦在4^oC、12000rpm的條件下，離心5min使RNA沉淀；

⑧移去上清，用1mL的-20^?oC預冷的75%乙醇洗滌沉淀兩次，在超凈工作臺內吹干后，加入10～20μL的DEPC（焦炭酸二乙酯）處理水溶解RNA，于-80^?oC保存。

本發明的工作原理如下：

細胞裂解液中的SDS（Sodium?Dodecyl?Sulfonate，十二烷基磺酸鈉）能破壞細胞膜，進而迅速抑制細胞內的RNA酶，從而保證釋放出來的RNA的完整性。EDTA（Ethylene?Diamine?Tetraacetic?Acid，乙二胺四乙酸）是一種金屬離子螯合劑，也能抑制需要金屬離子輔助的RNA酶的活性。而PVP（Polyvinyl?Pyrrolidone，聚乙烯吡咯烷酮）和β-巰基乙醇都是還原劑，防止酚類物質被氧化而和RNA結合。