[發明專利]一種大規模合成長鏈RNA藥物的生產新工藝

在審

• 申請號: 201310053753.4
• 申請日: 2013-02-19
• 公開（公告）號: CN103993002A
• 公開（公告）日: 2014-08-20
• 發明（設計）人: 張平靜;李鐵軍;周宋峰;朱遠源;陳建新;陸毅祥;文鋒
• 申請（專利權）人: 百奧邁科生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;A61K48/00
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司 31001
• 代理人: 翁若瑩;王婧

技術領域

本發明涉及一種大規模轉錄合成長鏈RNA藥物的生產新工藝，尤其是具有穩定二級結構的長鏈RNA藥物，以RNA聚合酶轉錄甲氧基修飾的DNA模板大規模合成長鏈RNA藥物分子，HPLC純化RNA藥物去除內毒素、蛋白、DNA等殘留物。

背景技術

在過去的數十年間，隨著siRNA、非編碼RNA、RNA適配體、核酶等RNA技術飛速發展，RNA在生物學上越來越受到重視(John?C等.Chemistry?&?Biology.2012，19(1)：60-71)，以往的一些合成方法已逐漸不能滿足科研試驗和藥物研發對RNA的需求，越來越多的RNA生物學研究和藥物研發中需要用到毫克級甚至克級的高純度RNA，與此同時對RNA產品的質量也提出了更高的要求(Laura?E等.RNA.2010，16(3)：647-653)。目前RNA合成的主要方法是化學合成法，該方法最大的優點就是可以規模化合成，但是也存在缺點和技術限制，其一就是價格昂貴，其二是現有合成技術水平只能合成短鏈RNA藥物分子，合成RNA長度一旦超過40nt左右時，其合成效率大幅降低，副產物序列增多，這不僅加大了下游純化的難度，還進一步推高了成本(張中華.生命科學.2004，16(4)：231-235)(Junichi?Yano等.Advances?in?Polymer?Science，2012，249：1-48)(趙松子等.西北農業學報.2010，16(5)：47-51)。目前，大多數研究人員往往通過轉錄合成的方法獲得大于40nt左右的RNA，即用T7、T3或SP6RNA聚合酶轉錄帶有其啟動子的雙鏈DNA模板獲得長單鏈RNA(SA?McKenna等.Nature?Protocols.2007，2，3270-3277)。一般情況下，通過優化轉錄條件中的Mg²⁺、三磷酸核苷酸(rNTP)的濃度，一個拷貝DNA模板能產生幾十到數百個拷貝的RNA，因此通過這種方法可以得到較大量的RNA產物。采用生物合成RNA的方法具有諸多優點，例如可以進行同位素標記或熒光染料進行標記；轉錄長度不受限制等，因此其廣泛用于核酸結構或生物學研究。

然而，轉錄合成RNA分子也存在一些問題。無法實現穩定的規模化生產，其原因在于需要制備大量的質粒并用DNA限制性內切酶酶切成線性質粒；或需要通過大量的PCR反應獲得線性模板，而一些具有穩定二級結構的長鏈RNA(RNA分子5’端和3’端不完全或完全互補堿基數不少于5個)的DNA轉錄模板單鏈也會相應具有穩定二級結構，這導致利用DNA引物PCR擴增轉錄模板時產生非特異性或突變DNA產物，而這些非目的DNA轉錄的RNA與目的RNA的生物學功能截然不同，因此無法通過PCR方法獲得足夠量的正確DNA轉錄模板。例如miRNA前體或RNA適配體即為此類具有穩定二級結構的長鏈RNA(YYoshida等.Analytical?and?Bioanalytical?Chemistry.2009，395(4)：1089-1096)。由于生物合成的RNA藥物往往步驟較多，要用到Taq酶、RNA聚合酶、質粒等生物材料，這些材料大多數為從大腸桿菌中提取而來，因此帶有大量的細菌內毒素，合成的RNA產物也會帶有大量的內毒素和蛋白殘留，如果用這些RNA作為藥物進行體內細胞功能研究時，往往對試驗產生副作用和干擾作用，甚至可能引起細胞和試驗動物的死亡(張平靜等.中國生物工程雜志.2011，31(4)：106-112)。用RNA聚合酶進行轉錄時往往產生截短的轉錄中止副產物；轉錄反應完畢后T7?RNA聚合酶往往會在RNA產物的3’端添加數個額外的核苷酸，因而生物法制備而來的RNA往往均一性不理想(C?Kao等.RNA.1999，5(9)：1268-1272)。本領域技術人員所熟知的凝膠電泳或酚/氯仿抽提純化RNA產物，即無法達到規模化也無法達到細胞或動物實驗的質量要求；HPLC已經應用于化學合成RNA寡核苷酸片段的純化，其能分辨出寡核苷酸之間一個核苷酸的差異，但是一旦寡核苷長度大于40個以上時，分離效果也會逐漸變差(TP?Shields等.RNA.1999，5(9)：1259-1267)。因此，大規模純化大于40nt的長鏈RNA仍然是該技術領域內的難題(A?Azarani等.Nucleic?Acids?Research.2001，29(2)：E7)。