[發(fā)明專利]一種大規(guī)模合成長鏈RNA藥物的生產(chǎn)新工藝

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201310053753.4
• 申請日: 2013-02-19
• 公開（公告）號: CN103993002A
• 公開（公告）日: 2014-08-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張平靜;李鐵軍;周宋峰;朱遠(yuǎn)源;陳建新;陸毅祥;文鋒
• 申請（專利權(quán)）人: 百奧邁科生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;A61K48/00
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司 31001
• 代理人: 翁若瑩;王婧

1.一種大規(guī)模合成長鏈RNA藥物的生產(chǎn)新工藝，其特征在于，具體步驟包括：

第一步：設(shè)計雙鏈DNA轉(zhuǎn)錄模板：所述的雙鏈DNA轉(zhuǎn)錄模板由正義鏈和反義鏈組成，其中正義鏈由T7啟動子序列和連接在T7啟動子序列后的與長鏈RNA藥物序列一致的DNA序列組成，反義鏈?zhǔn)桥c正義鏈序列完全互補的DNA序列；

根據(jù)上述設(shè)計的雙鏈DNA轉(zhuǎn)錄模板設(shè)計兩條DNA引物，其中正向引物的序列與DNA轉(zhuǎn)錄模板正義鏈從5’端起始的一部分的序列相同，反向引物為的序列與DNA轉(zhuǎn)錄模板反義鏈從5’端起始的一部分的序列相同；正向引物3’端序列和反向引物3’端序列之間至少有10個連續(xù)堿基完全反向互補；

第二步：模板制備：化學(xué)合成得到第一步中的兩條DNA引物，按摩爾數(shù)比1∶1混合后退火形成不完全互補雙鏈；在pfu?DNA聚合酶的作用下補平后形成第一步中的雙鏈DNA轉(zhuǎn)錄模板；所述的雙鏈DNA轉(zhuǎn)錄模板由雙鏈RNA聚合酶啟動子序列和連接在雙鏈RNA聚合酶啟動子序列后的與長鏈RNA藥物序列對應(yīng)的DNA序列兩部分組成；

第三步：模板純化：將第二步得到的雙鏈DNA轉(zhuǎn)錄模板用異丙醇沉淀，然后用乙醇洗滌后用無內(nèi)毒素水溶解，得到純化后的雙鏈DNA轉(zhuǎn)錄模板；

第四步：體外轉(zhuǎn)錄：將第三步所得的純化后的雙鏈DNA轉(zhuǎn)錄模板在RNA聚合酶的作用下，以三磷酸核苷混合物為原料，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，在雙鏈RNA聚合酶啟動子序列的引導(dǎo)下，轉(zhuǎn)錄出長鏈RNA藥物；

第五步：RNA產(chǎn)物純化：將第四步得到的長鏈RNA藥物使用陰離子交換色譜柱在高壓液相色譜儀上直接純化，線性梯度洗脫，將收集的長鏈RNA藥物在凝膠過濾色譜柱上進(jìn)行脫鹽處理；收集長鏈RNA藥物并冷凍干燥，獲得純化后的長鏈RNA藥物；

第六步：純化后RNA純度檢測：將第五步所得的長鏈RNA藥物進(jìn)行瓊脂糖或聚丙酰胺凝膠電泳檢測、HPLC分析檢測、內(nèi)毒素殘留檢測、DNA殘留檢測以及蛋白殘留檢測中的至少一種。

2.如權(quán)利要求1所述的大規(guī)模合成長鏈RNA藥物的生產(chǎn)新工藝，其特征在于，所述的長鏈RNA藥物為序列長度為30-200bp的長單鏈RNA。

3.如權(quán)利要求1所述的大規(guī)模合成長鏈RNA藥物的生產(chǎn)新工藝，其特征在于，所述的長鏈RNA藥物序列上至少有自身完全互補的5個連續(xù)堿基形成二級空間結(jié)構(gòu)。

4.如權(quán)利要求1所述的大規(guī)模合成長鏈RNA藥物的生產(chǎn)新工藝，其特征在于，所述第五步所得的純化后的長鏈RNA藥物的量為至少10mg。

5.如權(quán)利要求1所述的大規(guī)模合成長鏈RNA藥物的生產(chǎn)新工藝，其特征在于，所述的RNA聚合酶為T7RNA聚合酶，其內(nèi)毒素含量不超過100EU/mg。

6.如權(quán)利要求1所述的大規(guī)模合成長鏈RNA藥物的生產(chǎn)新工藝，其特征在于，所述的長鏈RNA藥物是siRNA、miRNA、miRNA前體、核酶、反義RNA、RNA適配體以及RNA探針的RNA組成鏈中的一種。

7.如權(quán)利要求1所述的大規(guī)模合成長鏈RNA藥物的生產(chǎn)新工藝，其特征在于，所述的長鏈RNA藥物為miRNA前體藥物。

8.如權(quán)利要求1所述的大規(guī)模合成長鏈RNA藥物的生產(chǎn)新工藝，其特征在于，所述的雙鏈DNA轉(zhuǎn)錄模板的反義鏈5’端的1～3個堿基為2’-OMe修飾。

9.如權(quán)利要求1所述的大規(guī)模合成長鏈RNA藥物的生產(chǎn)新工藝，其特征在于，所述的三磷酸核苷混合物為非修飾、氟代修飾、Cy3修飾或Cy5修飾的形式。