[發明專利]一種K562細胞擴增激活NK細胞的方法

有效

• 申請號: 201310053084.0
• 申請日: 2013-02-19
• 公開（公告）號: CN103232973A
• 公開（公告）日: 2013-08-07
• 發明（設計）人: 吳忠福;徐以兵;董生聚
• 申請（專利權）人: 浙江中贏方舟生物工程股份有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;A61K35/14;A61K35/28;A61P35/00;A61P35/02;A61P31/00;A61P33/00
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

技術領域

本發明屬于免疫學領域，具體是指使用跨膜白介素21，CD14，CD19，CD86和CD137轉染的K562細胞和低濃度白介素2共同作用定向擴增激活自然殺傷細胞(NK)的方法。

背景技術

NK細胞治療對腎細胞癌、黑素瘤、肺癌、結腸癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌和急性白血病等腫瘤治療有明顯療效。目前NK細胞治療在美國主要用來和手術、化療和放療聯合使用。NK細胞數量和殺傷功能與療效直接相關，治療中存在的問題在于獲得大量NK細胞非常困難。傳統使用的高劑量白介素2激活生長倍數有限，端粒酶活性降低，擴增后的NK細胞殺傷功能低下。本公司之前的發明采用K562細胞轉染跨膜IL-21和CD137復合物解決了這一問題。用該方法擴增的NK細胞純度和活性顯著增強，數量上可以達到臨床治療的需要。然而在腫瘤微環境(tumor?microenvironment)中存在有大量的TAMs(腫瘤相關巨噬細胞)和CD19+B細胞，這些細胞為腫瘤細胞的生長提供營養因子。用僅轉染跨膜IL-21和CD137復合物的K562細胞激活擴增的NK細胞雖然對腫瘤細胞有很強的殺傷能力，對腫瘤微環境中的腫瘤相關巨噬細胞和B細胞的殺傷能力卻很弱。

發明內容

本發明針對現有技術中的不足，提出一種更具有發展潛力的方法，實現NK細胞的擴增。

本發明是通過下述技術方案得以實現的：

在第一方面，本發明提供一種擴增激活淋巴細胞的方法，其特征在于，使用跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的混合物與白介素2共同作用擴增激活淋巴細胞，其中所述跨膜白介素21為白介素21與膜蛋白或膜蛋白的胞外結構域相連而成的復合物，優選地為白介素21與CD8α的胞外結構域相連而成的復合物；優選地，所述CD8α、白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137分別包含CD8α、白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的完整氨基酸序列或具備其功能的氨基酸序列片段。

在本發明的擴增激活淋巴細胞的方法中，可以加入兩次或更多次跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137混合物，優選地，所述跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137混合物的劑量可以為50pM-1000pM，更優選地可以為500pM～800pM。

在本發明的擴增激活淋巴細胞的方法中，所述跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的混合物可以為純化后的蛋白混合物或由同一宿主細胞即時表達。

在本發明的擴增激活淋巴細胞的方法中，所述淋巴細胞可以為純化的或未純化的，優選地，所述淋巴細胞可以是外周血淋巴細胞、純化的NK細胞、純化的NK細胞和外周血淋巴細胞的組合、純化的NK細胞或外周血淋巴細胞和別的淋巴細胞的組合、或白介素2和/或白介素21和/或CD137混合物注射進人體血管后作用的血液中所有白細胞，優選地所述純化可以是指NK細胞為細胞總數的50％以上。

在本發明的擴增激活淋巴細胞的方法中，跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137可以分別采用蛋白穩定表達系統，優選地，所述跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137各自的表達載體中均可以含有病毒啟動子和選擇標記基因。

在本發明的擴增激活淋巴細胞的方法中，所述宿主細胞可以為K562細胞；優選地，當所述跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137混合物同時由K562細胞即時表達時，所述K562細胞與淋巴細胞的用量比例可以為K562細胞：淋巴細胞=1-10：1，更優選地，可以為K562細胞：淋巴細胞=1-4：1，最優選地可以為2∶1-3∶1。

7、根據權利要求1至6中任一項所述的方法，其特征在于，其中所述白介素2的最低劑量可以為50單位/毫升，優選地，可以加入兩次或更多次所述白介素2。

本發明的擴增激活淋巴細胞的方法，所述方法可以包括：

（1）在含有所述淋巴細胞的培養液中，加入同時表達跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的經過輻照的K562細胞以及白介素2共同培養7天；

（2）將培養后的培養液離心，獲取細胞沉淀，并用與步驟（1）中等量的培養液重懸；和

（3）加入所述K562細胞，培養7天；