[發明專利]一種K562細胞擴增激活NK細胞的方法

有效

• 申請號: 201310053084.0
• 申請日: 2013-02-19
• 公開（公告）號: CN103232973A
• 公開（公告）日: 2013-08-07
• 發明（設計）人: 吳忠福;徐以兵;董生聚
• 申請（專利權）人: 浙江中贏方舟生物工程股份有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;A61K35/14;A61K35/28;A61P35/00;A61P35/02;A61P31/00;A61P33/00
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

1.一種擴增激活淋巴細胞的方法，其特征在于，使用跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的混合物與白介素2共同作用擴增激活淋巴細胞，其中所述跨膜白介素21為白介素21與膜蛋白或膜蛋白的胞外結構域相連而成的復合物，優選地為白介素21與CD8α的胞外結構域相連而成的復合物；優選地，所述CD8α、白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137分別包含CD8α、白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的完整氨基酸序列或具備其功能的氨基酸序列片段。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中加入兩次或更多次的跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137混合物，優選地，所述跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137混合物的劑量為50pM-1000pM，更優選地500pM～800pM。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的混合物為純化后的蛋白混合物或由同一宿主細胞即時表達。

4.根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其特征在于，所述淋巴細胞為純化的或未純化的，優選地，所述淋巴細胞是外周血淋巴細胞、純化的NK細胞、純化的NK細胞和外周血淋巴細胞的組合、純化的NK細胞或外周血淋巴細胞和別的淋巴細胞的組合、或白介素2和/或白介素21和/或CD137混合物注射進人體血管后作用的血液中所有白細胞，優選地所述純化是指NK細胞為細胞總數的50％以上。

5.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其特征在于，跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137分別采用蛋白穩定表達系統，優選地，所述跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137各自的表達載體中均含有病毒啟動子和選擇標記基因。

6.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述宿主細胞為K562細胞；優選地，當所述跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137混合物同時由K562細胞即時表達時，所述K562細胞與淋巴細胞的用量比例為K562細胞：淋巴細胞=1-10：1，更優選地，為K562細胞：淋巴細胞=1-4：1，最優選地為2∶1-3∶1。

7.根據權利要求1至6中任一項所述的方法，其特征在于，其中所述白介素2的最低劑量為50單位/毫升，優選地，加入兩次或更多次所述白介素2。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

（1）在含有所述淋巴細胞的培養液中，加入同時表達跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的經過輻照的K562細胞以及白介素2共同培養7天；

（2）將培養后的培養液離心，獲取細胞沉淀，并用與步驟（1）中等量的培養液重懸；和

（3）加入所述K562細胞，培養7天；

其中，優選地，所述培養液為：Eagle培養液加入10％人血清或10％小牛血清；或RPMI1640加入10％人血清或10％小牛血清；或F-10(Ham’s)Nutrient?mixtures加入10％人血清或10％小牛血清；優選地，所述輻照的劑量為100Gy-1000Gy。

9.根據權利要求1-8中任一項所述的方法，其特征在于，通過所述方法擴增的淋巴細胞溶于生理鹽水溶液，優選地用于靜脈滴注。

10.根據權利要求1-9中任一項所述的方法在制備在用于在受治療者中治療癌癥或傳染性疾病的藥物的制備中的應用，

其中，優選地所述受治療者是哺乳動物，更優選地是人類；

所述癌癥優選地為急性髓細胞性白血病、慢性淋巴瘤白血病、前列腺腫瘤、惡性黑色素瘤和腎細胞惡性腫瘤中的一種或至少兩種；

所述傳染性疾病優選為細菌、病毒、真菌或寄生蟲感染，更優選地為乙肝病毒，甲肝病毒，丙肝病毒和艾滋病毒感染。