[發(fā)明專利]一種改造重組酶Cre的方法及其在植物中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310052609.9
• 申請(qǐng)日: 2013-02-18
• 公開（公告）號(hào): CN103146818A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高淵;羅克明;文夢(mèng)玲;汪麗君;李超鋒
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;G01N1/30
• 代理公司: 重慶華科專利事務(wù)所 50123
• 代理人: 康海燕

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域中的植物基因工程領(lǐng)域，涉及對(duì)重組酶Cre進(jìn)行拆分，構(gòu)建新的Cre/loxp系統(tǒng)的方法及應(yīng)用。?

背景技術(shù)

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用非常廣泛，該技術(shù)在改良作物品質(zhì)，提高作物產(chǎn)量，減少除草劑、殺蟲劑等農(nóng)藥的使用量等方面做出了巨大貢獻(xiàn)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)給我們帶來巨大的經(jīng)濟(jì)利益和生態(tài)效益的同時(shí)，由于該技術(shù)不斷發(fā)展突破并且開發(fā)利用的時(shí)間尚短，轉(zhuǎn)基因植物在生態(tài)環(huán)境和食品安全等方面引起的質(zhì)疑越來越多，賈士榮等認(rèn)為目前人類還不能對(duì)該技術(shù)帶來的潛在危險(xiǎn)性做出正確評(píng)價(jià)，其主要原因是轉(zhuǎn)基因植物當(dāng)中的一些外源的選擇標(biāo)記基因的存在。Goldsbrough等采用轉(zhuǎn)座子技術(shù)、Komari等采用共轉(zhuǎn)化技術(shù)去除轉(zhuǎn)基因植物中的選擇標(biāo)記基因，而應(yīng)用最早、最廣泛、最深入的是位點(diǎn)特異性系統(tǒng)中的Cre/loxp系統(tǒng)。?

Cre/loxp系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)物、植物和酵母等生物體中，尤其在小鼠當(dāng)中的研究最為深入。Gilbertson等認(rèn)為Cre/loxp系統(tǒng)是植物生物技術(shù)領(lǐng)域中切除轉(zhuǎn)基因植物染色體上外源基因的重要工具。Sauer等早在1987年將該系統(tǒng)應(yīng)用于釀酒酵母，首次證明了來自原核細(xì)胞的Cre重組酶在真核細(xì)胞中也會(huì)發(fā)生基因敲除。Luo等采用組織特異性啟動(dòng)子Bgp啟動(dòng)重組酶的表達(dá)，在植物體特定的器官（種子或者花粉）中達(dá)到對(duì)外源標(biāo)記基因的刪除。但是特異性的啟動(dòng)子只能控制重組酶基因在特定部位的表達(dá)，從而大大限制了Cre/loxp系統(tǒng)的應(yīng)用范圍。?

蛋白-蛋白之間的相互作用對(duì)調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)等程序性的活動(dòng)扮演著重要的角色，一些技術(shù)被用來檢測(cè)活細(xì)胞當(dāng)中蛋白-蛋白之間的相互作用。Yukichi等將螢光素酶拆分為無活性的N端和C端，分別與組蛋白H2A和H2B融合，轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體后檢測(cè)到熒光素酶活性。Yang等在2003年將GUS報(bào)告基因拆分后轉(zhuǎn)化擬南芥，利用內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白互補(bǔ)技術(shù)在轉(zhuǎn)基因植物當(dāng)中恢復(fù)了GUS基因的酶活。?

大量研究表明，將一個(gè)完整的蛋白拆分為沒有活性的兩部分，通過借助一對(duì)相關(guān)的蛋白輔助因子，在兩部分分別融合其中的一個(gè)輔助因子，進(jìn)而達(dá)到蛋白質(zhì)的重建和活性的恢復(fù)。本發(fā)明對(duì)Cre/loxp系統(tǒng)中的重要元件重組酶Cre進(jìn)行直接拆分，將其拆分為無活性的N端和C端，將這兩部分共同轉(zhuǎn)化煙草發(fā)根，實(shí)現(xiàn)當(dāng)這兩部分在同一個(gè)植物細(xì)胞當(dāng)中時(shí)，恢復(fù)了重組酶的活性而發(fā)生基因刪除，反之將任何一部分單獨(dú)轉(zhuǎn)化，該系統(tǒng)均不具有刪除活性。采用該技術(shù)對(duì)Cre/loxp系統(tǒng)進(jìn)行改造之后，不僅可以獲得沒有活性的Cre/loxp系統(tǒng)，同時(shí)又可以根據(jù)需要使其在轉(zhuǎn)基因植物當(dāng)中恢復(fù)活性，增加了Cre/loxp系統(tǒng)的可控性和應(yīng)用范圍。本發(fā)明在植物當(dāng)中的應(yīng)用從未見報(bào)道。?

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種改造重組酶Cre的方法，并將其應(yīng)用于植物當(dāng)中。?

本發(fā)明中，所述的方法是利用蛋白拆分技術(shù)將重組蛋白Cre在第59和60個(gè)氨基酸之間直接拆分為無活性的N端（NCre）和C端（CCre）兩部分，對(duì)拆分蛋白進(jìn)行重組活性檢測(cè)。?

在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，將NCre和CCre構(gòu)建到原核表達(dá)載體pMAL-C2X上，誘導(dǎo)表達(dá)純化之后，體外檢測(cè)拆分蛋白的活性。?

本發(fā)明中，將含有一對(duì)同向識(shí)別位點(diǎn)loxp的融合基因loxP-nos-loxP構(gòu)建于pCAMBIA1305.1上得到中間載體pCA-LoxP，以此載體為骨架將不同的拆分蛋白構(gòu)建上去，得到本發(fā)明的含有Cre/loxp系統(tǒng)的所有的植物表達(dá)載體。?

在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，將所有的植物表達(dá)載體通過發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化煙草，獲得煙草轉(zhuǎn)基因毛狀根，通過GUS組織染色和PCR分子檢測(cè)改造的Cre/loxp系統(tǒng)的重組活性。?

在本發(fā)明中，體外蛋白實(shí)驗(yàn)證明拆分蛋白的NCre和CCre混合在一起的時(shí)候具有完整的Cre蛋白的活性。?

本發(fā)明中，將拆分蛋白NCre和CCre分別構(gòu)建的Cre/loxp系統(tǒng)轉(zhuǎn)化煙草后發(fā)現(xiàn)當(dāng)N端和C端（即NCre和CCre）在同一個(gè)植物細(xì)胞時(shí)恢復(fù)重組活性而發(fā)生刪除，反之則不能。這點(diǎn)與體外蛋白實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。?

附圖說明

圖1：重組酶Cre拆分為N端（NCre）和C端（CCre）的模型以及各部分融合NLS。?

圖2：重組蛋白Cre以及拆分蛋白NCre、CCre的體外誘導(dǎo)表達(dá)、純化以及活性檢測(cè)結(jié)果。?