[發明專利]一種改造重組酶Cre的方法及其在植物中的應用

有效

• 申請號: 201310052609.9
• 申請日: 2013-02-18
• 公開（公告）號: CN103146818A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 高淵;羅克明;文夢玲;汪麗君;李超鋒
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N1/30
• 代理公司: 重慶華科專利事務所 50123
• 代理人: 康海燕

1.一種改造重組酶Cre的方法，其特征在于，其包括以下步驟：

（1）將重組蛋白Cre在第59和60個氨基酸之間直接拆分為無活性的N端（NCre）和C端（CCre）兩部分，在各個拆分片段之前融合核定位信號NLS；

（2）將拆分蛋白NCre和CCre構建到原核表達載體pMAL-C2X上，誘導表達純化之后，體外檢測拆分蛋白的活性；

（3）將含有一對同向識別位點loxp的融合基因loxP-nos-loxP構建于pCAMBIA1305.1上得到中間載體pCA-LoxP，以此載體為骨架將拆分蛋白NCre和CCre構建上去，得到含有Cre/loxp系統的植物表達載體；

（4）將構建的植物表達載體通過發根農桿菌介導的遺傳轉化轉化模式植物煙草，獲得轉基因毛狀根，通過GUS組織染色和PCR分子檢測改造的Cre/loxp系統的重組活性。

2.根據權利要求1所述的改造重組酶Cre的方法，其特征在于，所述含有一對同向識別位點loxp的融合基因loxP-nos-loxP是這樣獲得的：采用人工合成融合片段loxP-nos-loxP，序列如下：5’-CGGGATCCGCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATAGATCTTCCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGGATCCCG-3’，下劃線分別為BamHⅠ、BglⅡ、BamHⅠ識別位點，將其用BamHⅠ從pES載體上切下后連接到BglⅡ酶切的載體pCAMBIA1305.1上，獲得的陽性克隆進行測序驗證，測序正確的質粒命名為pCA-LoxP，該載體中包括多克隆位點和GUS報告基因。

3.根據權利要求2所述的改造重組酶Cre的方法，其特征在于，含Cre/loxp系統的植物表達載體的構建方法如下：用BglⅡ酶切載體pCA-LoxP，將用BamHⅠ/BglII雙酶切后膠回收的片段NCre和nNCre分別連接到載體上，獲得載體pCA-NCre和pCA-nNCre；再將融合片段35S-CCre-nos和35SNLS-CCrenos用EcoRⅠ和HindⅢ從載體pCXSN上切下后連接到pCA-nNCre的多克隆位點，從而獲得載體pCA-CCre-nNCre和pCA-nCCre-nNCre；同時融合片段35S-CCrenos和35S-NLS-CCre-nos用EcoRⅠand?HindⅢ從載體pCXSN上切下后連接到pCA-LoxP上得到載體pCA-CCre和pCA-nCCre。

4.根據權利要求1、2或3所述的改造重組酶Cre的方法，其特征在于，體外蛋白實驗證明拆分蛋白的NCre和CCre混合在一起的時候具有完整的Cre蛋白的活性。

5.根據權利要求1、2或3所述的改造重組酶Cre的方法，其特征在于，將拆分蛋白NCre和CCre分別構建的Cre/loxp系統轉化模式植物煙草后發現當N端和C端（即NCre和CCre）在同一個植物細胞時恢復重組活性而發生刪除，反之則不能。

6.如權利要求1、2或3中所述的改造重組酶Cre的方法，其特征在于，將核定位信號NLS與拆分蛋白融合后的Cre/loxp系統的刪除效率明顯提高。

7.權利要求1-6之一所述的改造后的重組酶Cre在植物中的應用。