[發(fā)明專利]一種裂解時自動降解核酸的大腸桿菌制備的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310052355.0
• 申請日: 2013-02-18
• 公開（公告）號: CN103205448A
• 公開（公告）日: 2013-07-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐東;任昌義
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市亞太興實業(yè)有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19;C12R1/445
• 代理公司: 深圳中一專利商標(biāo)事務(wù)所 44237
• 代理人: 張全文

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種裂解時自動降解核酸的大腸桿菌制備方法。

背景技術(shù)

以大腸桿菌為宿主菌大規(guī)模胞內(nèi)表達(dá)重組蛋白過程中，在純化目的重組蛋白前，需破碎菌體以釋放目的蛋白，破菌后高分子量的宿主菌染色體核酸釋放至裂解液中，導(dǎo)致裂解液黏度顯著增加，給后續(xù)純化工作帶來困難。FDA對藥用重組蛋白的核酸污染限度要求嚴(yán)格(每劑量應(yīng)低于100pg)，因此去除核酸污染也是非常必要的。

非特異性水解磷酸二酯鍵的酶為磷酸二酯酶（phosphodiesterase）,專一性水解核酸的磷酸二酯酶為核酸酶。利用核酸酶降解核酸可降低破菌液的粘度。目前使破菌液中核酸降解以降低粘度的方法有兩種：一種為添加外源核酸酶，如來自Serratia?marcescens的Benzonase，其為經(jīng)基因工程改進的核酸內(nèi)切酶。其缺點在于費用過高不適宜于大規(guī)模生產(chǎn)。另一種替代方案是改造基因工程菌，使之能自動降解宿主染色體核酸。但是采用一般的重組方法改造菌株，效率很低。

金黃色葡萄球菌核酸酶(Staphylococcus?nuclease,簡稱SNase)是金黃色葡萄球菌分泌到胞外的一種核酸非專一性磷酸二酯酶，分子量16807道爾頓。該酶結(jié)構(gòu)簡單，為含有149個氨基酸殘基的單鏈球蛋白，它不含半胱氨酸和二硫鍵，能夠可逆地去折疊和重折疊，是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系、蛋白質(zhì)折疊動力學(xué)的重要模型。在Ca²⁺存在下，SNase可將DNA和RNA水解生成3'-單核苷酸和3'-二核苷酸，并表現(xiàn)出一定程度的序列特異性，傾向于作用AT富集區(qū)，能水解包括DNA、RNA，單鏈、雙鏈、環(huán)形、線形的核酸。因此可在利用大腸桿菌表達(dá)重組蛋白時裂解宿主菌的核酸以降低破菌液的粘度，從而提高純化效率。但在大腸桿菌中表達(dá)SNase時，也存在著表達(dá)量低，酶活不高，降解宿主染色體核酸的效果不明顯的缺點。因此需要提供一種既可高效表達(dá)SNase且能快速生長的大腸桿菌以提高重組蛋白的純化效率。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明實施例的目的在于提供一種裂解時自動降解核酸的大腸桿菌制備方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中利用大腸桿菌表達(dá)重組蛋白時裂解液粘度過高影響純化的問題。

本發(fā)明實施例是這樣實現(xiàn)的，一種裂解時自動降解核酸的大腸桿菌制備方法，該方法包括以下步驟：

將pelB信號肽編碼序列與金黃色葡萄球菌核酸酶基因序列連接，得第一組合序列，其中該pelB信號肽編碼序列在該金黃色葡萄球菌核酸酶基因序列上游；

將該第一組合序列與卡那霉素抗性基因序列連接，得到第二組合序列，其中第一組合序列在卡那霉素抗性基因序列上游；

用上述第二組合序列替換大腸桿菌JM109的ptsG基因序列，獲得ptsG基因缺失的大腸桿菌JM109；

將上述ptsG基因缺失的大腸桿菌JM109中的第二組合序列中的卡那霉素抗性基因敲除。

本發(fā)明的裂解時自動降解核酸的大腸桿菌制備方法具有如下優(yōu)點：1、同源重組效率高；2、所得菌株能在37°C無抗性培養(yǎng)基條件下快速生長；3、制得的大腸桿菌表達(dá)的金黃色葡萄球菌核酸酶（SNase）可分泌至周質(zhì)空間，直接發(fā)揮作用，簡化純化步驟；4、SNase基因表達(dá)的產(chǎn)物不會影響其它目的蛋白的表達(dá)，不會給宿主菌增加生長負(fù)荷；5、ptsG基因的敲除能降低發(fā)酵過程中乙酸的積累，減少細(xì)胞毒性，促進菌體生長。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例的裂解時自動降解核酸的大腸桿菌制備方法操作流程；

圖2為本發(fā)明實施例的裂解時自動降解核酸的大腸桿菌制備方法獲得的第二組合序列的酶切檢驗電泳圖；

圖3為本發(fā)明實施例的裂解時自動降解核酸的大腸桿菌制備方法獲得的ptsG::SNase重組大腸桿菌PCR鑒定圖；

圖4為本發(fā)明實施例1制備的目的重組大腸桿菌的SDS-PAGE電泳驗證圖；

圖5為本發(fā)明實施例1制備的目的重組大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白降解染色體DNA的電泳圖。

具體實施方式

為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明所用術(shù)語“敲除”為分子生物學(xué)常用術(shù)語，通常是指將某段特定基因或序列從宿主中完全地去掉。

本發(fā)明實施例提供一種裂解時自動降解核酸的大腸桿菌制備方法，包括以下步驟：