[發明專利]一種裂解時自動降解核酸的大腸桿菌制備的方法

有效

• 申請號: 201310052355.0
• 申請日: 2013-02-18
• 公開（公告）號: CN103205448A
• 公開（公告）日: 2013-07-17
• 發明（設計）人: 徐東;任昌義
• 申請（專利權）人: 深圳市亞太興實業有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19;C12R1/445
• 代理公司: 深圳中一專利商標事務所 44237
• 代理人: 張全文

1.一種裂解時自動降解核酸的大腸桿菌制備方法，該方法包括以下步驟：

將pelB信號肽編碼序列與金黃色葡萄球菌核酸酶基因序列連接，得第一組合序列，其中所述pelB信號肽編碼序列在所述金黃色葡萄球菌核酸酶基因序列上游；

將所述第一組合序列與卡那霉素抗性基因序列連接，得到第二組合序列，其中所述第一組合序列在所述卡那霉素抗性基因序列上游；

用所述第二組合序列替換大腸桿菌JM109的ptsG基因序列，獲得ptsG基因缺失的大腸桿菌JM109；

將所述ptsG基因缺失的大腸桿菌JM109的第二組合序列中的卡那霉素抗性基因敲除。

2.如權利要求1所述的裂解時自動降解核酸的大腸桿菌制備方法，其特征在于，所述pelB信號肽編碼序列為SEQ?ID?NO:1，所述金黃色葡萄球菌核酸酶基因序列為SEQ?ID?NO:2，所述卡那霉素抗性基因序列為SEQ?ID?NO:5。

3.如權利要求1所述的裂解時自動降解核酸的大腸桿菌制備方法，其特征在于，所述金黃色葡萄球菌核酸酶基因利用序列為SEQ?ID?NO:3和SEQ?IDNO:4的引物對克隆獲得。

4.如權利要求1所述的裂解時自動降解核酸的大腸桿菌制備方法，其特征在于，所述卡那霉素抗性基因序列以質粒pKD13為模板，利用序列為SEQ?IDNO:8和SEQ?ID?NO:9的引物對克隆獲得。

5.如權利要求1所述的裂解時自動降解核酸的大腸桿菌制備方法，其特征在于，所述將pelB信號肽編碼序列與金黃色葡萄球菌核酸酶基因序列連接通過將金黃色葡萄球菌核酸酶基因序列插入至載體pET獲得。

6.如權利要求1所述的裂解時自動降解核酸的大腸桿菌制備方法，其特征在于，所述卡那霉素抗性基因序列以質粒pKD13為模板克隆獲得，且其5’端和3’端均包含FRT位點。

7.如權利要求1所述的裂解時自動降解核酸的大腸桿菌制備方法，其特征在于，所述用第二組合序列替換大腸桿菌JM109的ptsG基因序列的步驟包括將質粒pKOBEG或質粒pKD46轉化至大腸桿菌JM109的操作。

8.如權利要求7所述的裂解時自動降解核酸的大腸桿菌制備方法，其特征在于，所述用第二組合序列替換大腸桿菌JM109的ptsG基因序列的步驟還包括將所述質粒pKOBEG或質粒pKD46去除的操作。

9.如權利要求1所述的裂解時自動降解核酸的大腸桿菌制備方法，其特征在于，所述將卡那霉素抗性基因敲除的步驟包括將質粒pCP20轉化至所述ptsG基因缺失的大腸桿菌JM109的操作。

10.如權利要求9所述的裂解時自動降解核酸的大腸桿菌制備方法，其特征在于，所述將卡那霉素抗性基因敲除的步驟還包括將所述質粒pCP20去除的操作。