[發(fā)明專利]兔出血癥病毒RT-PCR檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310052271.7
• 申請日: 2011-03-15
• 公開（公告）號: CN103146842A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發(fā)明（設計）人: 賈廣樂;蘇國清;林祥梅;武昱孜;孫衛(wèi)東
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;張慶敏

本申請是申請日為2011年3月15日，申請?zhí)枮椋?01110062529.2，發(fā)明名稱為“兔出血癥病毒熒光定量RT-PCR檢測方法”的專利申請之分案申請。

技術領域

本發(fā)明涉及一種兔出血癥病毒的分子檢測方法，具體地說，涉及一種兔出血癥病毒熒光定量RT-PCR檢測方法，其屬于生物技術領域。

背景技術

兔出血癥（Rabbit?hemorrhagic?disease，RHD）是由兔出血癥病毒（Rabbit?hemorrhagic?disease?virus，RHDV）引起的一種高度接觸烈性傳染病，傳播快，發(fā)病急，發(fā)病率和致死率都很高，以呼吸系統(tǒng)出血、肝壞死、實質臟器水腫、淤血及出血性變化為特征，是兔的一種毀滅性傳染病，目前所有已測的兔的品種都表現出易感性。自然條件下，RHDV主要侵害成年兔，2月齡以下的仔兔自然感染時一般不發(fā)病。該病對養(yǎng)兔業(yè)造成巨大的經濟損失，也嚴重威脅瀕臨滅絕的野兔品種。由此，RHDV引起了國內外學者高度重視，從形態(tài)學、生物化學和分子生物學等各個方面系統(tǒng)的研究該病毒。

RHDV在國際病毒分類委員會（ICTV）2000年最新的第七次報告中被列入新成立的杯狀病毒科（Caliciviridae）兔病毒屬（Lagovirus）。RHDV為單股正鏈RNA病毒，其基因組由7437個核苷酸組成，分子量為2.4×10⁶-2.6×10⁶，5’端沒有帽狀結構，而是共價結合與感染相關的Vpg（virion?protein,genome?linked）蛋白，3’末端具有一個短的PolyA尾。第1-9nt為5’非編碼區(qū)，最后59nt為3’非編碼區(qū)，含有兩個開放閱讀框架(ORF)，第10-7044nt為ORFl編碼的一個含有2344個氨基酸的多聚蛋白，該多聚蛋白經蛋白水解酶加工成主要衣殼蛋白VP60以及包括RNA聚合酶和蛋白酶在內的三個非結構蛋白。根據分析，該病毒的RNA基因組結構與同科的貓嵌杯樣病毒不一樣，僅含有兩個開放閱讀框。

RHDV的免疫原性蛋白、衣殼蛋白VP60，在誘導抗病毒感染的免疫反應中起重要作用，是病毒免疫保護性抗原。VP60基因全長1740bp，在病毒誘導機體的免疫反應中起主要作用，其核苷酸極端保守。RHDV是一種急性、高度致死性RNA病毒，在兔體內停留時間短，沒有足夠的時間讓病毒發(fā)生有利于進化的變異，因此幾十年中RHDV仍然能保持高序列同源性。

目前，已有將分子生物學應用到RHDV診斷中的研究，其主要包括玻片凝集試驗（SHA）檢測RHDV、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測RHDV、RT-PCR檢測RHDV等，但上述這些方法存在敏感性低、可重復性差、結果判定易受多種因素影響、處理耗時多等問題。

熒光定量PCR（fluorescence?quantitative?polymerase?chain?reaction），又稱實時定量（real-time?quantitative）PCR。這種技術是在PCR技術基礎上發(fā)展起來的高度靈敏的核酸定量技術。它是一種在PCR體系中引入了熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，使PCR擴增和終產物檢測全處在封閉的條件下進行，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析方法，具有實時監(jiān)測、無污染、快速、靈敏、精確、特異等特點，極大的克服了傳統(tǒng)PCR技術普遍存在的假陽性及不能定量等問題，其最主要的優(yōu)勢是能對待測樣本起始PCR反應模板進行準確定量，擴大了PCR的應用范圍，使得PCR技術更廣泛的應用于臨床，在監(jiān)測患者病情、預后、指導用藥等方面。目前已廣泛應用于分子生物學研究和醫(yī)學研究等領域。