[發明專利]兔出血癥病毒RT-PCR檢測方法

無效

• 申請號: 201310052271.7
• 申請日: 2011-03-15
• 公開（公告）號: CN103146842A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 賈廣樂;蘇國清;林祥梅;武昱孜;孫衛東
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;張慶敏

1.用于兔出血癥病毒RT-PCR檢測的引物，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.4和5所示。

2.含有權利要求1所述引物的檢測試劑盒。

3.如權利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，PCR反應體系為：

每25μL反應液中含有：10×RT-PCR緩沖液2.5μL、超純dNTP混合物1μL，各10mM、5×RT-PCR增強劑5μL、40U/μL?RNA酶抑制劑0.25μL、2.5U/μL?Hotmaster?DNA聚合酶1.25μL、Quant反轉錄酶0.25μL、10mmol/L的上下游引物各0.5μL、RNA模板1μL、RNase-free?ddH₂O補至25μL。

4.如權利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，PCR反應條件為：50℃、30min；94℃、2min，94℃、1min，51.7℃、1min，65℃、1min，擴增35個循環；65℃、10min。

5.權利要求1所述引物在制備用于檢測兔出血癥病毒陽性標準品中的應用。

6.如權利要求5所述的應用，其特征在于，包括以下步驟：

1）提取RHDV病毒RNA，用核苷酸序列如SEQ?ID?No.4和5所示的引物，進行一步法RT-PCR擴增，得到目的片段；然后將該目的片段克隆到pGEM-T?Easy載體上，轉入感受態細胞大腸桿菌DH5α，提取白斑陽性質粒；

2）對提取的質粒進行Sac?Ⅰ酶切，使質粒DNA線性化，然后在T7RNA聚合酶作用下體外轉錄RNA，得到陽性標準品。

7.如權利要求6所述的應用，其特征在于，步驟2）酶切的反應體系為：RE10×緩沖液2μL、乙酰化的BSA0.2μL、質粒DNA2.3μL、10U/μL?Sac?Ⅰ0.5μL、ddH₂O補加至20μL。

8.如權利要求6所述的應用，其特征在于，步驟2）酶切的反應條件為：37℃溫度下孵育1h。

9.如權利要求6所述的應用，其特征在于，體外轉錄RNA的反應體系為：5倍優化轉錄緩沖液4μL；DTT2μL、重組核糖核酸酶抑制劑0.5μL；rATP、rGTP、rUTP和rCTP混合物4μL；線性化DNA8μL；19U/μL?T7RNA聚合酶1μL；DEPC水補加至20μL。

10.如權利要求6所述的應用，其特征在于，體外轉錄RNA的反應條件為：37℃溫度下孵育1h，然后加入RQ1?0.5μL，37℃溫度下孵育15min。