[發明專利]一種酶法快速定量檢測heparosan的方法

有效

• 申請號: 201310050183.3
• 申請日: 2013-02-08
• 公開（公告）號: CN103149198A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 鐘衛鴻;黃海嬋;趙穎穎;呂沈聰
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: G01N21/75
• 分類號: G01N21/75;G01N21/31
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

（一）技術領域

本發明涉及一種酶法快速定量檢測heparosan的方法。

（二）背景技術

Heparosan，又稱N-acetylheparosan，（-GlcUA-1,4-GlcNAc-1,4-）_n,是E.coli?O10:K5:H4（簡稱E.coli?K5）等菌株莢膜中多糖骨架的二糖重復單位，可作為肝素和硫酸乙酰肝素的生物合成前體。目前heparoan的檢測方法主要有硫酸-咔唑法、干重法，干重法需要將細菌發酵液進行分離、醇沉、烘干、稱量等步驟，最后獲得的粗多糖中含有較多雜質（蛋白質、其他多糖等），測量精度差。而硫酸咔唑法是適用范圍比較廣的一種糖醛酸含量的測定方法，多糖含量的測定也是通過先測定多糖中糖醛酸的含量，再換算成多糖的含量，該方法目前廣泛應用于軟骨素、透明質酸、肝素、硫酸乙酰肝素、黃瓜多糖、果膠多糖等酸性多糖中糖醛酸含量的測定，該測定方法易受試劑或樣品中雜質（葡萄糖、鹽、鐵離子等）的干擾，存在操作繁瑣、重現性差、干擾因素多、專一性差等缺點。

而選定合適的酶，進行酶法檢測具有快速、簡便、專一性強和高精密度等優點，目前在實際應用中越來越廣。HeparinaseⅢ酶（EC4.2.2.8）為黃桿菌（flavobacterium?heparinum）中提取的細菌肝素酶，能特異性裂解N-硫酸化或N-乙?；咸烟前罚℅lcNSO₃或GlcNAc）與葡萄糖醛酸之間的糖苷鍵。目前研究者已證明heparinaseⅢ酶能降解硫酸乙酰肝素，但還未有報道將heparinaseⅢ酶應用于heparosan或硫酸乙酰肝素含量檢測。

（三）發明內容

本發明的目的是為了提供一種的酶法快速定量檢測heparosan的方法，該方法與硫酸咔唑法、干重法相比具有專一性強，精度高、重現性好等優點。

本發明采用的技術方案是：

一種酶法快速定量檢測heparosan的方法，所述方法包括：

（1）取待測樣品，溶于pH7.0~7.5的緩沖液中配制成樣品溶液，混勻，25~35℃下平衡0.1~10min，加入足量Heparinase?III酶，混勻，25~35℃水浴0.1~3h，加入HCl溶液，離心混勻，取上清液進行紫外分光光光度計檢測，以未進行酶反應的樣品為空白對照，讀出樣品的吸光度值A_235nm；所述待測樣品可以是提取后的heparosan樣品，也可以是含有heparosan的粗品或E.coli?K5發酵上清液等；

（2）配制梯度濃度的heparosan標準品溶液，按照步驟（1）方法進行反應和檢測，繪制吸光度值與底物濃度的標準曲線；

（3）對照標準曲線，根據樣品吸光度值A_235nm，獲得樣品溶液中heparosan濃度值，換算得到樣品中heparosan含量。

所述步驟（1）緩沖液組成如下：Tris?HCl10~50mM，NaCl40~80mM，CaCl₂1~4mM，牛血清蛋白0.005~0.02%（w/w），溶劑為水，pH7.0~7.5。

對酶反應體系進行優化，所述方法如下：

（1）取待測樣品，溶于緩沖液A中配制成樣品濃度1~500g/L的樣品溶液（樣品為提取后的heparosan樣品時，樣品濃度為1~10g/L為宜，樣品為含有heparosan的粗品時，樣品濃度可為100~500g/L，優選為300~500g/L），取0.6mL樣品溶液，混勻，25~35℃下平衡0.1~10min，加入Heparinase?III酶液0.05mL，混勻，25~35℃水浴0.1~3h，加入50mMHCl溶液2.35mL，離心混勻，取上清液進行紫外分光光光度計檢測，以未進行酶反應的樣品為空白對照，讀出樣品的吸光度值A_235nm；所述緩沖液A組成如下：Tris?HCl20mM，NaCl50mM，CaCl₂4mM，牛血清蛋白0.01%，溶劑為水，pH7.5；所述Heparinase?III酶液由Heparinase?III酶溶于緩沖液A制得，酶液單位酶活大于165U/mL;

（2）配制梯度濃度的heparosan標準品溶液，按照步驟（1）方法進行反應和檢測，繪制吸光度值與底物濃度的標準曲線；

（3）對照標準曲線，根據樣品吸光度值A_235nm，獲得樣品溶液中heparosan濃度值，換算得到樣品中heparosan含量。