[發(fā)明專利]一種酶法快速定量檢測heparosan的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310050183.3
• 申請日: 2013-02-08
• 公開（公告）號: CN103149198A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鐘衛(wèi)鴻;黃海嬋;趙穎穎;呂沈聰
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: G01N21/75
• 分類號: G01N21/75;G01N21/31
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

1.一種酶法快速定量檢測heparosan的方法，所述方法包括：

（1）取待測樣品，溶于pH7.0~7.5的緩沖液中配制成樣品溶液，混勻，25~35℃下平衡0.1~10min，加入足量Heparinase?III酶，混勻，20~35℃水浴0.1~3h，加入HCl溶液，離心混勻，取上清液進(jìn)行紫外分光光光度計(jì)檢測，以未進(jìn)行酶反應(yīng)的樣品為空白對照，讀出樣品的吸光度值A(chǔ)_235nm；

（2）配制梯度濃度的heparosan標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照步驟（1）方法進(jìn)行反應(yīng)和檢測，繪制吸光度值與底物濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

（3）對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品吸光度值A(chǔ)_235nm，獲得樣品溶液中heparosan濃度值，換算得到樣品中heparosan含量。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟（1）緩沖液組成如下：TrisHCl10~50mM，NaCl40~80mM，CaCl₂1~4mM，牛血清蛋白0.005~0.02%，溶劑為水，pH7.0~7.5。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下：

（1）取待測樣品，溶于緩沖液A中配制成樣品濃度1~500g/L的樣品溶液，取0.6mL樣品溶液，混勻，25~35℃下平衡0.1~10min，加入Heparinase?III酶液0.05mL，混勻，25~35℃水浴0.5~3h，加入50mM?HCl溶液2.35mL，離心混勻，取上清液進(jìn)行紫外分光光光度計(jì)檢測，以未進(jìn)行酶反應(yīng)的樣品為空白對照，讀出樣品的吸光度值A(chǔ)_235nm；所述緩沖液A組成如下：Tris?HCl20mM，NaCl50mM，CaCl₂4mM，牛血清蛋白0.01%，溶劑為水，pH7.5；所述Heparinase?III酶液由HeparinaseIII酶溶于緩沖液A制得，酶液單位酶活大于165U/mL；

（2）配制梯度濃度在0.1~10g/L之間的heparosan標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照步驟（1）方法進(jìn)行反應(yīng)和檢測，繪制吸光度值與底物濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

（3）對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品吸光度值A(chǔ)_235nm，獲得樣品溶液中heparosan濃度值，換算得到樣品中heparosan含量。