[發(fā)明專利]胰島素的制備方法

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• 申請日: 2013-02-07
• 公開（公告）號: CN103981243A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發(fā)明（設計）人: 雅各布·哈特曼;江立新
• 申請（專利權）人: 華凌科技有限公司
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K1/20;C07K1/18;C07K1/14
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 李丙林;張英

技術領域

本發(fā)明涉及將胰島素前體轉化為長效活性胰島素化合物的改進的方法。

背景技術

胰島素是參與血糖濃度調節(jié)的一種胰腺激素。例如，將人、豬和牛的胰島素、胰島素類似物和混合胰島素給予胰島素依賴型糖尿病患者，以調節(jié)他們的血糖濃度。

成熟胰島素是一種兩條鏈的肽激素，含有51個氨基酸。其A-鏈由21個氨基酸組成，B-鏈由30個氨基酸組成。該分子含有2個鏈間二硫鍵和1個A-鏈內二硫鍵。在體內，該激素首先被合成為一條長的前體分子，即前胰島素原(preproinsulin)，隨后被加工為胰島素原(proinsulin)和胰島素。最初的加工步驟是在初生鏈穿過內質網膜轉移期間經蛋白水解而除去前肽。然后，胰島素原折疊并伴隨二硫鍵氧化并轉運至高爾基體，在此包裝成為分泌液泡。在此經特異性蛋白酶進一步加工形成成熟胰島素。通過這樣的蛋白水解切割，將胰島素原中連接B鏈和A鏈的C-鏈(C肽)切去。C肽長度為35個氨基酸并在其氨基端和羧基端分別包含2對堿性氨基酸，即ArgArg和LysArg(Steiner,1984)。一般認為,將兩條胰島素鏈連接在一起的C肽有助于合適的折疊和二硫鍵的形成。事實上，其缺失或被僅有一個到數(shù)個氨基酸長的較短的合成肽橋取代，仍然允許自胰島素-樣前體產生合適的胰島素。

直到20世紀80年代，胰島素仍是從牛和豬的胰腺制品中分離。早期研究已經證明，可通過將呈S-磺酸形式的A鏈和B鏈結合或通過還原型胰島素原的自發(fā)再氧化而在體外生產胰島素。然后再經胰蛋白酶和羧肽酶B處理而回收胰島素。然而，這些方法對于大規(guī)模生產來說并不實用。以后，通過轉肽作用(例如美國專利號4,343,898)，使用胰蛋白酶和蘇氨酸，替代豬胰島素中的B30丙氨酸(豬胰島素和人胰島素之間的唯一差異)，可自豬胰島素產生半合成人胰島素。

例如EP87,238提供了在溶劑系統(tǒng)中進行的轉肽反應，所述溶劑系統(tǒng)包含介于大約75%至97%(v/v)之間的至少一種非水反應易混溶劑，其包含至少大約50%(vol/vol)丁-1,4-二醇。通過使用L-絲氨酸特異性羧肽酶而進行的轉肽方法公開于美國專利號4,579,820。

發(fā)明內容

在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種制備胰島素的方法，所述方法包括以下步驟：(a)可逆地封閉Lys-Arg前體胰島素中的賴氨酸殘基，包括使所述Lys-Arg前體胰島素接觸包含緩沖液和檸康酸酐的pH6-11的溶液；和(b)切割所述Lys-Arg前體胰島素，包括使步驟(a)的所述Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應，從而制備胰島素。

在一個實施方案中，本發(fā)明還提供一種制備胰島素的方法，所述方法包括以下步驟：將Lys-Arg前體胰島素暴露在11.0-11.5的pH值下；(b)可逆地封閉所述Lys-Arg前體胰島素中的賴氨酸殘基，包括使所述Lys-Arg前體胰島素接觸包含緩沖液和檸康酸酐的pH6-11的溶液；和(c)切割所述Lys-Arg前體胰島素，包括使步驟(b)的所述Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應，從而制備胰島素。

在一個實施方案中，本發(fā)明還提供一種制備胰島素的方法，所述方法包括以下步驟：(a)可逆地封閉Lys-Arg前體胰島素中的賴氨酸殘基，包括使所述Lys-Arg前體胰島素接觸包含緩沖液和檸康酸酐的pH9的溶液；(b)切割所述Lys-Arg前體胰島素，包括使步驟(a)的所述Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應；和(c)將步驟(b)的所述胰島素的pH調節(jié)至pH6-10(步驟(c))，從而制備胰島素。

在一個實施方案中，本發(fā)明的方法還包括胰島素純化操作，例如：微濾、離子交換色譜法、反相高壓液相色譜法(RP-HPLC)或其任意組合。

在一個實施方案中，本發(fā)明的方法還包括胰島素結晶，包括在檸檬酸-乙醇(pH6.4)中使所述胰島素接觸Zn++。

附圖說明

圖1是描述自Lys-Arg胰島素前體制備本發(fā)明胰島素的方法流程。

圖2是胰島素-LysArg生產流程。

圖3是純化的胰島素-LysArg的RP-HPLC分析圖及與市售來得時(Lantus)的比較。來得時之前的峰是防腐劑間甲酚。

圖4是本發(fā)明的重組人胰島素-類似物前體表達盒的核苷酸序列和相應氨基酸序列。B鏈氨基酸在方框內。A鏈氨基酸在方框內。在胰島素-類似物序列之前的最初64個氨基酸(編碼Cu/Zn-超氧化物歧化酶的部分序列)和Lys?Arg橋用粗體表示。RBS–核糖體結合位點。