[發明專利]胰島素的制備方法

在審

• 申請號: 201310049462.8
• 申請日: 2013-02-07
• 公開（公告）號: CN103981243A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 雅各布·哈特曼;江立新
• 申請（專利權）人: 華凌科技有限公司
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K1/20;C07K1/18;C07K1/14
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 李丙林;張英

1.一種制備胰島素的方法，所述方法包括以下步驟：

（a）可逆地封閉包含SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:2的氨基酸序列的Lys-Arg前體胰島素中的賴氨酸殘基，包括使所述Lys-Arg前體胰島素接觸包含緩沖液和檸康酸酐的pH6-10的溶液；和

（b）切割所述Lys-Arg前體胰島素，包括使步驟(a)的所述Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應，

從而制備胰島素。

2.權利要求1所述的方法，其中所述使所述Lys-Arg前體胰島素接觸檸康酸酐是在pH9時進行。

3.權利要求1所述的方法，其中所述使所述Lys-Arg前體胰島素接觸檸康酸酐是在室溫下進行大約1小時。

4.權利要求1所述的方法，其中所述使步驟(a)的所述Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應是在pH值為6.0-11.5時進行。

5.權利要求1所述的方法，其中所述使步驟(a)的所述Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應是在室溫下進行。

6.權利要求5所述的方法，其中所述使步驟(a)的所述Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應進行至少5小時。

7.權利要求5所述的方法，其中所述使步驟(a)的所述Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應進行23小時。

8.權利要求1所述的方法，其中在步驟(a)之前將所述Lys-Arg前體胰島素暴露在10.0-11.5的pH值下。

9.權利要求1所述的方法，所述方法還包括步驟(c)，即，將步驟(b)的所述胰島素的pH調節至pH8.5。

10.權利要求1所述的方法，所述方法還包括從步驟(b)的所述胰島素的B-鏈的C-端除去Arg殘基和Lys殘基，包括使步驟(b)的所述胰島素與羧肽酶B(CPB)反應。

11.權利要求9所述的方法，所述方法還包括純化所述胰島素(步驟(d))。

12.權利要求11所述的方法，其中通過微濾進行所述純化。

13.權利要求11所述的方法，其中通過離子交換色譜法、反相高壓液相色譜法(RP-HPLC)或這兩者進行所述純化。

14.權利要求11所述的方法，所述方法還包括使所述胰島素結晶，包括在檸檬酸-乙醇中使步驟(d)的所述胰島素接觸Zn++。

15.權利要求1所述的方法，其中所述胰島素是長效胰島素。

16.權利要求1所述的方法，其中將至少50%的所述Lys-Arg前體胰島素轉化為所述胰島素。

17.權利要求1所述的方法，其中所述前體胰島素得自細菌包涵體。

18.權利要求1所述的方法，其中所述溶液不含胺。

19.權利要求1所述的方法，其中所述緩沖液是碳酸鹽緩沖液。

20.權利要求1所述的方法，其中包含SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:2的氨基酸序列的所述Lys-Arg前體胰島素是由SEQ?ID?NO:3的氨基酸序列組成的Lys-Arg前體胰島素。