[發明專利]一種以超順磁納米顆粒為固相進行多肽合成及同步構建多肽磁納米探針的方法

有效

• 申請號: 201310049011.4
• 申請日: 2013-02-06
• 公開（公告）號: CN103965285A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發明（設計）人: 沙印林;羅聃
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C07K1/06
• 分類號: C07K1/06;C07K1/04;C12N5/09;C12N13/00;A61K49/14;G01N21/00
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;費碧華

技術領域

本發明涉及一種多肽固相合成的方法，特別涉及一種以超順磁納米顆粒為固相的多肽合成方法，并在合成多肽的同時同步構建了合成多肽納米磁探針，可用于其生物功能的檢測，本發明屬于多肽固相合成技術領域。

背景技術

1、固相多肽合成技術：

固相多肽合成技術是當今生物化學領域的重要技術，該技術的先驅是RobertBruce Merrifield。盡管當今有多種獲得多肽的方法（如利用細菌表達等），但仍然有許多多肽序列難以獲得（如細菌難以表達的序列）。利用多肽合成技術可以幫助我們在實驗室中簡便獲得該序列的肽。同時在合成的過程中，可在序列中任意加入非天然氨基酸或者小分子化合物，這都是其它方法難以比擬的。多肽合成技術中，可分為液相合成技術和固相合成技術。其中固相多肽合成技術已經發展完善成為該技術的主流。其原理在于利于小珠子作為固相，珠子上修飾官能團可以和氨基酸單體形成共價鍵，按照設計序列分別按順序與氨基酸單體反應既可以得到多肽序列。在合成的過程中，多肽穩定地共價結合于固相珠子表面，反應結束后利用特殊化學試劑可將多肽序列從固相珠子上切下。相比于液相合成技術，固相合成法在珠子上進行，更容易進行中間產品的提取和分離，給合成帶來了極大的便利。合理設計的固相是該技術的關鍵，其應當滿足以下幾點：

1）固相可簡便，快捷地與液相分離

2）固相化學性質穩定，可以穩定存在于反應的溶劑中，化學惰性好

3）固相上存在官能團，可以與氨基酸偶聯

滿足上述條件的固相從材料上又可以分為以下三種：

1）凝膠型固相（指含有官能團的高聚物）其中包括：苯乙烯固相，聚丙烯酰胺固相，聚乙二醇固相等

2）表面型固相：包含多孔玻璃珠，纖維素纖維等

3）復合型固相：指由剛性基質支撐的凝膠型高聚物

2、超順磁性納米顆粒：

當鐵氧體材料減小至一定尺度時，在一定溫度下，鐵晶各向異性能壘可與顆粒的熱動能抵消，宏觀表現為各磁晶磁矩雜亂無章互相抵消，從而不表現出磁性。當在外加磁場的作用下，磁晶磁矩傾向于沿外磁場方向排列，從而表現出磁性。富有這種性質的磁性納米顆粒被稱為超順磁納米顆粒。超順磁納米顆粒在外磁場的作用下便于操控性，同時可用于核磁共振成像、藥物輸送等，具有巨大的應用價值。

發明內容

本發明的目的是提供一種以超順磁納米顆粒為固相進行多肽合成及同步構建多肽磁納米探針的方法。

為了達到以上目的，本發明所采用的技術方案為：

本發明的一種以超順磁納米顆粒為固相進行多肽合成及同步構建多肽磁納米探針的方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）制備二氧化硅包殼的超順磁納米顆粒，表面暴露氨基；

（2）二氧化硅包殼的超順磁納米顆粒，通過HBTU/HOBt/DIEA的偶聯策略在其表面偶聯rink amide linker（4-[(2,4-二甲氧基苯基)(Fmoc-氨基)甲基]苯氧乙酸）；

（3）分別以二氧化硅包殼的超順磁納米顆粒和偶聯rink amide linker的二氧化硅包殼的超順磁納米顆粒為固相，利用HBTU/HOBt/DIEA的偶聯策略以Fmoc保護的氨基酸為單體，同步逐個接上氨基酸，進行多肽合成；

（4）分別向兩組固相中加入K試劑，所述的K試劑由三氟醋酸，苯甲硫醚，1,2-二巰基乙烷，苯酚以及水配制而成，優選的三氟醋酸，苯甲硫醚，1,2-二巰基乙烷，苯酚以及水的體積比為82.5：5：2.5：5：5；K試劑針對兩種不同的固相起不同的作用：

a對于偶聯rink amide linker的二氧化硅包殼的超順磁納米顆粒的固相，用于將合成的多肽脫側鏈保護并從該固相上切下；

b對于二氧化硅包殼的超順磁納米顆粒的固相，用于將合成多肽脫側鏈保護但不將多肽切下，得到綴合多肽的磁納米探針；

（5）將上述步驟（4）a中從偶聯rink amide linker的二氧化硅包殼的超順磁納米顆粒固相上切下的多肽以乙醚沉降，收集產品并用MALDI-TOF-MS（基質輔助激光解析電離飛行時間質譜,英文名Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry）驗證合成多肽的化學結構；

（6）將上述步驟（4）b中由二氧化硅包殼的超順磁納米顆粒固相得到的綴合多肽的磁納米探針溶于PBS（磷酸緩沖液）中，通過體外和體內實驗印證合成肽是否具有生物學功能。