[發明專利]多能干細胞的傳代方法及其用途

有效

• 申請號: 201310048507.X
• 申請日: 2013-02-06
• 公開（公告）號: CN103146641A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 蔣斌;李天晴;季維智;牛昱宇
• 申請（專利權）人: 云南中科靈長類生物醫學重點實驗室
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735;C12N5/02;C12N5/071
• 代理公司: 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙) 11371
• 代理人: 李世喆

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及多能干細胞的傳代方法及其用途。

背景技術

多能干細胞（Pluripotent?Stem?Cells，PSCs）可以在體外適宜的條件下快速增殖而不分化，并且在經過體外大量擴增后，再給予特定條件處理，例如使用蛋白質或小分子化合物的組合誘導，可以使其定向的分化成具有特定功能的細胞，將這些分化后失去多能性的特定細胞收集起來就可用于治療人類的相關疾病，例如可以將多能干細胞誘導成神經細胞后，注入大腦內用于治療因神經元缺損導致的老年性癡呆或亨廷頓氏癥。

工業化生產中，多能干細胞的常見增殖培養方式是貼壁培養和懸浮培養。其中，相比貼壁培養，懸浮培養方式有很多優點，適用于工業化大規模的生產模式，是未來干細胞生物研究和應用發展的趨勢所亟需的技術：懸浮培養的多能干細胞的分布呈球形，易于操作處理和回收細胞；懸浮培養可以充分利用空間及培養基，便于集中控制并降低成本，提高效率；懸浮系統產出的多能干細胞更利于向特定功能細胞如神經前體細胞和中胚層心肌前體細胞分化。

細胞培養過程中，當多能干細胞增殖達到一定密度后，需要進行傳代，進行再培養。現有的傳代方法主要有機械傳代、酶消化傳代，以及酶消化加機械傳代三種方式。

現有的機械傳代是利用極細的玻璃絲將大的集落劃切成數枚小片傳代，可用于貼壁培養，而懸浮培養的多能干細胞呈實體球狀，其毫無附著，無法固定，很難用玻璃絲將其劃開，因而不適宜用現有機械傳代。

酶消化傳代是向細胞中加入胰酶等酶進行消化處理，使細胞分散后傳代；可用于貼壁培養，而酶消化對懸浮培養的細胞球表面的細胞起作用快，而球內部細胞消化慢，造成消化不均一，影響了傳代細胞的性能，例如團塊大于150微米的多能干細胞小塊在接種到小鼠飼養層細胞上后易于自發分化，而小于40微米的多能干細胞小塊則易于死亡。因而懸浮培養不適宜用酶消化傳代。

酶消化配合移液槍吹打相較單獨酶消化，雖然消化相對均勻，但傳代時仍不易掌握和控制，導致制備的小團塊大小不均一，無法抑制自發分化，并且降低定向分化的可行性。并且長期采用酶消化，容易引起多能干細胞發生染色體變異或缺失。

可見，現有的細胞傳代方法不適于懸浮培養多能干細胞的傳代。

發明內容

本發明提供了一種多能干細胞的傳代方法及其用途，實現了懸浮培養體系中多能干細胞的傳代。

本發明的技術方案是這樣實現的：

多能干細胞的傳代方法，包括下列步驟：

步驟A：將多個多能干細胞小球移入培養基中，并混合均勻；

步驟B：利用移液器吸取混于培養基的所述多能干細胞小球，并利用所述移液器產生的壓力擠壓混于培養基的所述多能干細胞小球，使其通過30-70μm細胞篩的篩網，形成混于培養基的多能干細胞小團塊；

步驟C：將所述混于培養基的多能干細胞小團塊移入新的培養皿中，繼續培養，完成傳代；

所述多能干細胞小球為懸浮培養形成的多能干細胞的球狀聚集體，并且所述多能干細胞小球的直徑為240±40μm。

進一步地，所述步驟B包括：

利用移液器將混合后的混于培養基的所述多能干細胞小球，分批通過30-70μm細胞篩的篩網；

并且每批吸取800μl混于培養基的所述多能干細胞小球，每批在所述篩網的不同位置通過。

進一步地，所述步驟A包括：

將每70-90個所述多能干細胞小球移入3ml所述培養基中，并混合均勻。

進一步地，所述移液器為移液槍，所述移液槍所用的槍頭為帶濾芯槍頭。

進一步地，所述步驟A之前進一步包括：

向所述培養基中加入10μmol/L?Rock抑制劑Y-27632，并將所述培養基在37℃水浴中預熱。

進一步地，所述步驟A中的混合均勻包括：

利用移液管或移液槍反復吸吹。

進一步地，所述繼續培養包括：

將所述培養皿置于37℃，含5%CO₂的培養箱中。

進一步地，所述步驟B之后和所述步驟C之前進一步包括：

用磷酸鹽緩沖液或培養基潤濕所述培養皿的底部的內表面。

進一步地，所述細胞篩為尼龍篩網的無菌細胞篩，和/或，

所述培養基為無血清成分確定培養基；和/或，所述培養皿為皮氏培養皿。

所述的多能干細胞的傳代方法的用途，所述多能干細胞的傳代方法用于脊椎動物門的胚胎干細胞和誘導多能性干細胞的傳代。