[發(fā)明專利]多能干細(xì)胞的傳代方法及其用途

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310048507.X
• 申請(qǐng)日: 2013-02-06
• 公開（公告）號(hào): CN103146641A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔣斌;李天晴;季維智;牛昱宇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 云南中科靈長(zhǎng)類生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室
• 主分類號(hào): C12N5/0735
• 分類號(hào): C12N5/0735;C12N5/02;C12N5/071
• 代理公司: 北京超凡志成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11371
• 代理人: 李世喆

1.多能干細(xì)胞的傳代方法，其特征在于，包括下列步驟：

步驟A：將多個(gè)多能干細(xì)胞小球移入培養(yǎng)基中，并混合均勻；

步驟B：利用移液器吸取混于培養(yǎng)基的所述多能干細(xì)胞小球，并利用所述移液器產(chǎn)生的壓力擠壓混于培養(yǎng)基的所述多能干細(xì)胞小球，使其通過30-70μm細(xì)胞篩的篩網(wǎng)，形成混于培養(yǎng)基的多能干細(xì)胞小團(tuán)塊；

步驟C：將所述混于培養(yǎng)基的多能干細(xì)胞小團(tuán)塊移入新的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)，完成傳代；

所述多能干細(xì)胞小球?yàn)閼腋∨囵B(yǎng)形成的多能干細(xì)胞的球狀聚集體，并且所述多能干細(xì)胞小球的直徑為240±40μm。

2.如權(quán)利要求1所述的多能干細(xì)胞的傳代方法，其特征在于，所述步驟B包括：

利用移液器將混合后的混于培養(yǎng)基的所述多能干細(xì)胞小球，分批通過30-70μm細(xì)胞篩的篩網(wǎng)；

并且每批吸取800μl混于培養(yǎng)基的所述多能干細(xì)胞小球，每批在所述篩網(wǎng)的不同位置通過。

3.如權(quán)利要求2所述的多能干細(xì)胞的傳代方法，其特征在于，所述步驟A包括：

將每70-90個(gè)所述多能干細(xì)胞小球移入3ml所述培養(yǎng)基中，并混合均勻。

4.如權(quán)利要求1所述的多能干細(xì)胞的傳代方法，其特征在于，所述移液器為移液槍，所述移液槍所用的槍頭為帶濾芯槍頭。

5.如權(quán)利要求1所述的多能干細(xì)胞的傳代方法，其特征在于，所述步驟A之前進(jìn)一步包括：

向所述培養(yǎng)基中加入10μmol/L?Rock抑制劑Y-27632，并將所述培養(yǎng)基在37℃水浴中預(yù)熱。

6.如權(quán)利要求3所述的多能干細(xì)胞的傳代方法，其特征在于，所述步驟A中的混合均勻包括：

利用移液管或移液槍反復(fù)吸吹。

7.如權(quán)利要求6所述的多能干細(xì)胞的傳代方法，其特征在于，所述繼續(xù)培養(yǎng)包括：

將所述培養(yǎng)皿置于37℃，含5%CO₂的培養(yǎng)箱中。

8.如權(quán)利要求7所述的多能干細(xì)胞的傳代方法，其特征在于，所述步驟B之后和所述步驟C之前進(jìn)一步包括：

用磷酸鹽緩沖液或培養(yǎng)基潤(rùn)濕所述培養(yǎng)皿的底部的內(nèi)表面。

9.如權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的多能干細(xì)胞的傳代方法，其特征在于，所述細(xì)胞篩為尼龍篩網(wǎng)的無菌細(xì)胞篩，和/或，

所述培養(yǎng)基為無血清成分確定培養(yǎng)基；和/或，所述培養(yǎng)皿為皮氏培養(yǎng)皿。

10.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的多能干細(xì)胞的傳代方法的用途，其特征在于，所述多能干細(xì)胞的傳代方法用于脊椎動(dòng)物門的胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的傳代。