[發(fā)明專利]一種定點(diǎn)修飾N-末端的聚乙二醇化生長激素拮抗劑及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310047046.4
• 申請(qǐng)日: 2013-02-06
• 公開（公告）號(hào): CN103087182A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡濤;吳玲;蘇志國;馬光輝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院過程工程研究所
• 主分類號(hào): C07K14/61
• 分類號(hào): C07K14/61;C07K1/107
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種定點(diǎn)修飾N-末端的聚乙二醇（PEG）化生長激素拮抗劑，以及其制備方法。

背景技術(shù)

生長激素的主要作用在于促進(jìn)生長，涉及調(diào)節(jié)身體的生長，以及調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂類的代謝。生長激素的代謝作用由胰島素樣生長因子-I（IGF-I）介導(dǎo)。垂體生長激素腺瘤是常見的垂體腫瘤之一，由于生長激素（GH）過度分泌、IGF-I濃度增高，導(dǎo)致巨人癥和肢端肥大癥，其病亡率可高達(dá)20%-30%。目前的治療方法主要是減少或抑制生長激素的分泌，以降低生長激素的水平，防止生長激素的過度分泌，但是治療效果不佳。

生長激素拮抗劑（GHA）可通過阻止生長激素與其受體（GHR）的結(jié)合，阻止后續(xù)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，降低血漿IGF-I的水平，從而達(dá)到治療的目的。GHA是通過置換人生長激素（hGH）的8個(gè)氨基酸殘基，并用基因工程的方法表達(dá)出來的一種蛋白質(zhì)。這8個(gè)氨基酸殘基在人生長激素第1結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)，對(duì)生長激素與GHR的結(jié)合功能特別重要。其中，第18位天冬氨酸取代組氨酸（H18D）、第21位天冬酰胺取代組氨酸（H21N）、第167位天冬酰胺取代精氨酸（R167N）、第168位丙氨酸取代賴氨酸（K168A）、第171位絲氨酸取代天冬氨酸（D171S）、第172位精氨酸取代賴氨酸（K172R）、第174位絲氨酸取代谷氨酸（E174S）和第179位蘇氨酸取代異亮氨酸（I179T）。通過氨基酸的置換，使第1結(jié)合位點(diǎn)與GHR的親和力大為增加。

此外，B2036是一種人生長激素的9個(gè)氨基酸殘基被置換的蛋白質(zhì)。除了置換上述8個(gè)氨基酸殘基以外，還有第1結(jié)合位點(diǎn)的第120位甘氨酸取代賴氨酸（G120K）。然而，B2036分子與GHR二聚體的親和力卻與人生長激素相當(dāng)。這是由于盡管B2036的第1結(jié)合位點(diǎn)與GHR的親和力有所增加，但第2結(jié)合位點(diǎn)幾乎失去了與GHR的結(jié)合能力，從而能夠抑制生長激素的生物學(xué)功能。由于B2036在體內(nèi)的血漿半衰期短，僅為15-20分鐘，所以不能持續(xù)阻斷生長激素的功能。在臨床使用時(shí)需要加大給藥量和給藥次數(shù)，并帶來一定的毒副作用，增加了病人的痛苦與經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

聚乙二醇（PEG）修飾被認(rèn)為是一種能有效克服蛋白質(zhì)藥物血漿半衰期短的方法之一。這是因?yàn)镻EG自身有著巨大的優(yōu)勢(shì)，它是一種線性的、在溶液中可自由卷曲且不帶電荷的聚合物，具有無毒、微弱的抗原性和良好的生物相容性，已被美國FDA批準(zhǔn)用于人體。目前已有多種PEG修飾的蛋白質(zhì)藥物被美國FDA批準(zhǔn)上市，如PEG修飾的干擾素α2a（Pegasys,Roche公司）等。使用PEG共價(jià)修飾蛋白質(zhì)，可以延長蛋白質(zhì)的體內(nèi)循環(huán)半衰期，降低蛋白質(zhì)的免疫原性，增加蛋白質(zhì)的溶解性以及改變蛋白質(zhì)在人體內(nèi)的生物學(xué)分布。PEG修飾蛋白質(zhì)和多肽主要是氨基修飾（包括N端氨基的?；揎?、賴氨酸側(cè)鏈氨基的?；揎?、N端氨基的烷基化修飾）、羧基修飾以及巰基修飾等。其中，定點(diǎn)修飾主要包括N-末端修飾和半胱氨酸殘基修飾。N-末端修飾是通過PEG醛與一定量的還原劑如氰基硼氫化鈉（NaCNBH₃）在偏酸的環(huán)境下進(jìn)行的還原烷基化反應(yīng)。