[發明專利]果糖賴氨酸的制備方法

有效

• 申請號: 201310047017.8
• 申請日: 2013-02-06
• 公開（公告）號: CN103113428A
• 公開（公告）日: 2013-05-22
• 發明（設計）人: 鄒炳德;鄒繼華;陸慧賢;周海濱
• 申請（專利權）人: 寧波美康生物科技股份有限公司
• 主分類號: C07H15/12
• 分類號: C07H15/12;C07H1/00;G01N21/78
• 代理公司: 寧波市鄞州甬致專利代理事務所(普通合伙) 33228
• 代理人: 代忠炯

技術領域

本發明涉及果糖賴氨酸，即由葡萄糖和氨基酸反應形成的Amadori產物的制備方法。

背景技術

血液中的糖化白蛋白反應了一段時期內生物體內的血糖水平，近年來被用作糖尿病診斷和治療的重要指標。目前市場上主要采用酶法用于檢測人體內糖化白蛋白的含量，利用該法測定糖化白蛋白需用到一類特殊的酶類——果糖賴氨酸氧化酶，該酶作用于糖化多肽或糖化氨基酸，其作用產物經過一系列氧化還原反應，最后通過終產物的顯色來確定糖化白蛋白的含量。因此果糖賴氨酸氧化酶為糖化白蛋白測定中的關鍵酶。

目前研究表明，人血液中糖化白蛋白糖基化的位點為賴氨酸ε-NH2殘基，因此制備人血液糖化白蛋白的模擬底物，即果糖賴氨酸[N_ε-（1-脫氧-D-果糖-1-yl）-賴氨酸]，對篩選高活性、高穩定性及高特異性的果糖賴氨酸氧化酶及研究其酶學性質格外重要。該底物的實質即是氨基酸與還原糖通過美拉德（Maillard）反應生成的中間產物——Amadori化合物。其反應原理是還原糖的羰基與氨基酸的氨基之間進行加成，加成物迅速失去1分子水轉變為希夫（Schiff）堿，再經環化形成相應的N-取代的醛，最后通過Amadori重排形成較穩定的1-氨基-1-脫氧-2-酮糖。具體的反應過程如下：

目前，合成Amadori化合物的方法主要采用“加熱回流”法，通常是通過葡萄糖和氨基酸直接在無水甲醇中回流數小時，但因副反應比較多，要得到純度較高的Amadori化合物，則必須經過提純。在已有的Amadori化合物分離提純技術中，主要有陽離子交換樹脂分離、纖維素柱分離、硅膠柱分離等，其中以陽離子交換樹脂分離提純應用最為廣泛。但是，由于不同的氨基酸之間本身存在分子量大小、帶電性狀、疏水性狀及空間結構的差異，利用上述方法制備相應的Amadori化合物存在一定的局限性，即會出現收率過低、純度不高的結果。因此需要改進現有的技術方法來解決上述弊端。

發明內容

本發明針對現有技術的上述不足，提供一種果糖賴氨酸的制備方法，該方法具有收率高且得到的底物純度高的優點。

本發明的果糖賴氨酸，其結構式如下所示：

為實現上述技術效果，本發明采用如下技術方案：一種果糖賴氨酸的制備方法，包括以下制備步驟：

（1）以1~10重量份的賴氨酸α-NH2衍生物、10~100重量份的D-葡萄糖為原料，80~800重量份醇溶液為溶劑，放入反應容器中，設定反應溫度為40~90℃進行回流反應；

（2）反應經1~10h后，停止加熱，冷卻；

（3）將冷卻后的反應液控制真空度為-0.01~-0.09MPa、溫度為30~50℃進行減壓蒸干，得到干物質，在所得的干物質中加入20~150重量份純水，待溶解后得溶液；

（4）將步驟（3）的溶液以0.1~5mL/min的流速泵入到強酸性陽離子交換樹脂層析柱中，完畢后，先用純水以1~8mL/min流速洗脫，以除去殘留的糖，當所得洗脫液與葡萄糖檢測試劑反應不顯色時，開始改用0.01~3mol/L、pH3~6的吡啶甲酸鹽或吡啶乙酸鹽溶液洗脫，當所得洗脫液與底物檢測試劑反應顯色時，開始收集洗脫液，直至所得洗脫液與底物檢測試劑反應不顯色或顏色極淺為止；

（5）將步驟（4）收集的洗脫液進行冷凍干燥，得到的固體物質溶于1~2mol/L鹽酸溶液中，室溫放置過夜，以脫去保護基團；

（6）將步驟（5）放置過夜的試液冷凍干燥，得到固體物質以1:0.5~10（g/mL即重量與體積比）比例溶于甲醇或乙醚中，在0~10℃下放置，析出白色固形物，過濾，經冷凍干燥后所得的白色固體物質即為果糖賴氨酸。

本發明上述的賴氨酸α-NH₂衍生物為賴氨酸a-氨基的一個氫原子被其他化合物取代后所得到的衍生物，用于保護賴氨酸的α-NH2，上述衍生物例如：Nα-芐氧羰基-L-賴氨酸，Nα-叔丁氧羰基-L-賴氨酸，Nα-芴甲氧羰基-L-賴氨酸，Nα-馬尿酰基-L-賴氨酸，Nα-甲酰基-L-賴氨酸，Nα-甲酰基-L-賴氨酸。

本發明上述的醇溶液為無水甲醇或無水乙醇溶液。

本發明上述的葡萄糖檢測試劑的配方：緩沖液（0.01~1mol/L，pH5~8.5），葡萄糖氧化酶（1~16KU/L），過氧化氫的顯色系統；過氧化氫的顯色系統包括：過氧化物酶（0.5~10KU/L），色原（0.2~10mmol/L）和成色劑（0.2~10mmol/L）；上述各組分濃度均為在整體葡萄糖檢測試劑中的濃度。