[發(fā)明專利]通過(guò)聚乙二醇的介導(dǎo)將致誘變核堿基引入植物原生質(zhì)體的改進(jìn)的誘變方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310047014.4
• 申請(qǐng)日: 2007-12-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103146757A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: P·邦道克;M·T·J·德博特;F·呂西耶
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 凱津公司
• 主分類號(hào): C12N15/87
• 分類號(hào): C12N15/87
• 代理公司: 北京戈程知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11314
• 代理人: 程偉

本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?00780101787.9，申請(qǐng)日為2007年12月21日，發(fā)明名稱為“通過(guò)聚乙二醇的介導(dǎo)將致誘變核堿基引入植物原生質(zhì)體的改進(jìn)的誘變方法”的中國(guó)專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及通過(guò)將單鏈DNA寡核苷酸致誘變核堿基引入細(xì)胞而在靶細(xì)胞中的DNA特定位點(diǎn)上特異性和選擇性改變核苷酸序列的方法。更特別地，本發(fā)明涉及通過(guò)使用聚乙二醇（PEG）將致誘變核堿基引入植物原生質(zhì)體的定向誘變的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有致誘變核堿基和PEG的試劑盒。本發(fā)明還涉及PEG用于增強(qiáng)定向誘變的用途。

背景技術(shù)

有意地在活細(xì)胞的遺傳物質(zhì)中產(chǎn)生改變的過(guò)程具有修飾所述細(xì)胞或生物體（所述細(xì)胞形成該生物體的一部分或能夠再生形成該生物體）的一個(gè)或多個(gè)遺傳編碼的生物學(xué)特征的目的。這些改變可以采取下列形式：刪除部分遺傳物質(zhì)、添加外源性遺傳物質(zhì)或改變遺傳物質(zhì)的已有核苷酸序列。人們知道改變真核生物遺傳物質(zhì)的方法已經(jīng)有20多年，所述方法在植物、人和動(dòng)物細(xì)胞和微生物中有廣泛的應(yīng)用，用于農(nóng)業(yè)、人類健康、食品質(zhì)量和環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域中的改進(jìn)。最常見(jiàn)的方法由向細(xì)胞的基因組中加入外源性DNA片段組成，這將賦予所述細(xì)胞或其生物體優(yōu)于或超過(guò)已有基因所編碼的性質(zhì)的新性質(zhì)（包括其中已有基因的表達(dá)將因此被抑制的應(yīng)用）。雖然許多這樣的例子在獲得所需性質(zhì)中是有效的，然而這些方法不是十分精確，因?yàn)閷?duì)外源性DNA片段插入至基因組的位置沒(méi)有控制（因而對(duì)最終的表達(dá)水平?jīng)]有控制），并且因?yàn)樗璧男Ч仨毻ㄟ^(guò)優(yōu)于原始的和平衡良好的基因組所編碼的天然性質(zhì)表現(xiàn)出來(lái)。相反，引起預(yù)先確定的基因組位點(diǎn)中的核苷酸的添加、刪除或轉(zhuǎn)換的定向誘變的方法將允許精確地修飾已有的基因。另外，由于定向誘變的精確特性，可以預(yù)料的是以此方式獲得的新型植物系將更易于被消費(fèi)者接受。

定向誘變是一種定點(diǎn)誘變的方法，其基于將合成的致誘變核堿基（由以其Watson-Crick堿基配對(duì)性質(zhì)與DNA相似但在化學(xué)上可以不同于DNA的短串核苷酸樣部分（moietie）組成）遞送進(jìn)入真核細(xì)胞核(Alexeev和Yoon?Nature?Biotechnol16:13431998;Rice?Nature?Biotechnol.19:321,2001;Kmiec,J.Clin.Invest.112:632,2003)。一旦被引入細(xì)胞，這樣的致誘變核堿基在靶位點(diǎn)上與互補(bǔ)序列堿基配對(duì)。通過(guò)有意地在核堿基中設(shè)計(jì)錯(cuò)配，該錯(cuò)配可以在靶基因組序列中的相應(yīng)位置上引起核苷酸轉(zhuǎn)換。該方法允許在內(nèi)源性位點(diǎn)上轉(zhuǎn)換單個(gè)核苷酸或最多幾個(gè)核苷酸，但是可以應(yīng)用于在已有位點(diǎn)上產(chǎn)生終止密碼子，從而引起其功能的破壞，或產(chǎn)生密碼子改變，從而產(chǎn)生編碼具有改變的氨基酸組成的蛋白的基因（蛋白工程）。

在植物、動(dòng)物和酵母細(xì)胞中已經(jīng)描述了定向誘變。兩類不同的合成性致誘變核堿基已經(jīng)用于這些研究：嵌合的DNA:RNA核堿基或單鏈核堿基。