[發明專利]通過聚乙二醇的介導將致誘變核堿基引入植物原生質體的改進的誘變方法

有效

• 申請號: 201310047014.4
• 申請日: 2007-12-21
• 公開（公告）號: CN103146757A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: P·邦道克;M·T·J·德博特;F·呂西耶
• 申請（專利權）人: 凱津公司
• 主分類號: C12N15/87
• 分類號: C12N15/87
• 代理公司: 北京戈程知識產權代理有限公司 11314
• 代理人: 程偉

1.一種在植物細胞原生質體中定向改變雙鏈受體DNA序列的方法，其包括將雙鏈受體DNA序列與供體致誘變核堿基結合，其中雙鏈受體DNA序列含有第一DNA序列和與第一DNA序列互補的第二DNA序列并且其中供體致誘變核堿基相對于要改變的雙鏈受體DNA序列，優選相對于第一DNA序列包含至少一個錯配，其中該方法進一步包括使用聚乙二醇（PEG）介導的轉化將致誘變核堿基引入細胞原生質體中的步驟。

2.根據權利要求1所述的方法，其中致誘變核堿基是單鏈致誘變核堿基。

3.根據權利要求2所述的方法，其中單鏈致誘變核堿基的長度介于10-60個核苷酸之間。

4.根據權利要求1到3所述的方法，其中致誘變核堿基含有與錯配距離至少一個核苷酸的，并且，可選地，與致誘變核堿基的5’和3’末端距離至少3、4或5個核苷酸的鎖定的核酸（LNA）置換。

5.根據權利要求4所述的方法，其中單鏈致誘變核堿基含有位于與錯配的任一側距離至少一個核苷酸的兩個LNA。

6.根據權利要求1-4所述的方法，其中致誘變核堿基含有丙炔置換。

7.根據權利要求2-6所述的方法，其中單鏈致誘變核堿基與核定位信號結合。

8.根據任意前述權利要求所述的方法，其中受體DNA來自基因組DNA、線性DNA、哺乳動物人工染色體、細菌人工染色體、酵母人工染色體、植物人工染色體、核染色體DNA、細胞器染色體DNA或游離型DNA。

9.根據任意前述權利要求所述的方法，其用于改變細胞、通過恢復至野生型改正突變、誘導突變、通過打亂編碼區而使酶失活、通過改變編碼區而修飾酶的生物活性或通過打亂編碼區而修飾蛋白。

10.PEG介導的轉化用于增加植物原生質體中使用致誘變核堿基的定向誘變的效率相對于基于電穿孔的轉化的效率至少10倍的用途。

11.根據權利要求10所述的用途，其中致誘變核堿基是單鏈致誘變核堿基，優選地，其中單鏈致誘變核堿基的長度介于10-60個核苷酸之間。

12.根據權利要求10-11所述的用途，其中致誘變核堿基含有與定向錯配距離至少一個核苷酸的，并且，可選地，與致誘變核苷酸的5’和3’末端距離至少3、4或5個核苷酸的LNA置換。

13.根據權利要求12所述的用途，其中單鏈致誘變核堿基含有位于與錯配的任一側距離至少一個核苷酸的兩個LNA。

14.根據權利要求10-12所述的用途，其中致誘變核堿基含有丙炔置換。

15.根據任意前述權利要求所述的用途，其中受體DNA來自基因組DNA、線性DNA、哺乳動物人工染色體、細菌人工染色體、酵母人工染色體、植物人工染色體、核染色體DNA、細胞器染色體DNA或游離型DNA。

16.根據任意前述權利要求所述的用途，用于改變細胞、通過恢復至野生型改正突變、誘導突變、通過打亂編碼區而使酶失活、通過改變編碼區而修飾酶的生物活性或通過打亂編碼區而修飾蛋白。

17.利用根據權利要求1-9任一項所述的方法或利用根據權利要求10-16任一項所述的用途獲得的植物、植物細胞、植物細胞原生質體、植物愈傷組織或芽。