[發明專利]互花米草種群的SNP標記的分型方法

無效

• 申請號: 201310046929.3
• 申請日: 2013-02-05
• 公開（公告）號: CN103146817A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 陳建群;丁靜;王強;許穎;吳娟子
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標事務所(普通合伙) 32249
• 代理人: 陳建和

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種基于SNP標記的互花米草分子標記篩選技術。

背景技術

互花米草（Spartina?alterniflora）是一種原產北美大西洋沿岸的多年生草本植物。因其促淤造陸和消浪護堤作用顯著而被許多國家引種。1979年，南京大學從美國東南部的北卡羅萊納、喬治亞和佛羅里達引種了3種不同生態型互花米草至福建羅源灣，隨后擴大分布至我國海岸潮間帶遼寧丹東以南的廣大區域，并取得了一定的生態和經濟效益。但作為外來物種，其強大的繁殖能力和高大密集的種群特征，對我國沿海灘涂地區的生態系統、生物多樣性和水產養殖產生了較大的負面影響，2003年被環保總局列入我國第一批16種外來入侵物種名單。如今中國已成為全球遭受外來物種入侵危害最嚴重的國家之一，已發現外來入侵物種488種，其中50余種位列世界自然保護聯盟公布的全球100種最具威脅外來物種，每年造成的直接經濟損失達1200億元，治理投入更是難以估算。近年來入侵我國的外來生物更是呈現出傳入數量增多、傳入頻率加快、蔓延范圍擴大、發生危害加劇、經濟損失加重等趨勢。因此，生物入侵問題越來越受到世人的關注，包括其成因、危害及控制技術等諸多方面。但目前，大部分的研究主要集中在競爭性排斥、生態位替代、生物學特性、化感、捕食、寄生等生態過程，缺乏對其種群溯源、快速適應與進化模式、快速入侵與擴張動力等入侵機制方面的理解。

SNP標記是美國學者Lander?E于1996年提出的第三代DNA遺傳標記。SNP是指同一位點的不同等位基因之間僅有個別核苷酸的差異或只有小的插入、缺失等。從分子水平上對單個核苷酸的差異進行檢測，SNP標記可幫助區分兩個個體遺傳物質的差異。

組成DNA的堿基雖然有4種，但SNP一般只有兩種堿基組成，所以它是一種二態的標記，即二等位基因（biallelic）。由于SNP的二態性，非此即彼，在基因組篩選中SNPs往往只需+/-的分析，而不用分析片段的長度，這就利于發展自動化技術篩選或檢測SNPs。從分子水平上對單個核苷酸的差異進行檢測，SNP標記可幫助區分個體間遺傳物質的差異。

隨著SNP標記技術的成熟及其在分子生態學中的廣泛應用，外來物種種群溯源、入侵機理日益成為國際上研究的重點。大量的研究表明外來入侵種能在如此短的時間內迅速地做出適應性的進化，可能與其自身的遺傳結構密切相關。因而，在外來入侵物種上，亟需一種能夠有效揭示外來入侵物種遺傳本質的方法。

本發明以互花米草為對象，在整個基因組內批量尋找多態性位點，全面評估互花米草的多樣性，建立一種基于SNP標記的互花米草種群溯源方法，為進一步研究和控制互花米草等相關物種提供有力的技術支持。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于SNP標記的互花米草種群溯源方法，能夠在基因組序列信息較少的情況下，獲得大量的核苷酸多態性標記，發現引入的不同互花米草種群之間存在的遺傳變異，為揭示其遺傳本質和入侵機制，進一步研究和控制互花米草提供有力的技術支持。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：

一種鑒定外來入侵物種互花米草種群的DNA分子標記方法，步驟如下：

1)種群調查及取樣；

2)DNA提取；

3)測序；

4)篩選目標基因R71；

5)根據目標基因R71設計引物，正向引物如序列表中SEQ?ID?NO：1所示；反向引物如序列表中SEQ?IDNO：2所示；

6)PCR擴增；

7)測序；

8)序列拼接、比對，鑒定記錄單核苷酸多態性位點。

進一步地，所述目標基因R71是通過高通量轉錄組測序后篩選得到。

進一步地，所述PCR擴增的反應條件為：94℃預變性3min，94℃30s、54℃30s、72℃1.5min，39個循環，72℃延伸10min。

進一步地，所述目標基因R71在互花米草種群中有8個SNP位點，目標基因R71基因片段如序列表中SEQ?ID?NO：3所示，其中8個SNP位點分別位于73、117、135、179、224、230、254、616。

進一步地，高通量轉錄組測序的方法：提取樣本總RNA，用Oligo(dT)的磁珠富集分離mRNA，合成雙鏈cDNA，構建轉錄組測序文庫，插入片段長度約為500bp,在illumina?HiSeq2000測序儀上進行高通量測序，使用Trinity軟件對測序片段進行拼接，從而得到基因序列。