[發(fā)明專利]一種檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310045649.0
• 申請(qǐng)日: 2013-02-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103103283A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-05-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 唐卓;周麗
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及單核苷酸多態(tài)性的分析檢測(cè)，具體涉及一種普適的利用缺口-連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增目標(biāo)DNA，將DNAzyme序列引入連接產(chǎn)物中，然后利用Lambda外切酶降解沒(méi)有參與連接反應(yīng)的磷酸化探針，及外切酶III釋放DNAzyme的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

單核苷酸多態(tài)性(single?nucleotide?polymorphism，SNP)，主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，是基因組DNA中某一特定核苷酸位置上發(fā)生轉(zhuǎn)換、顛換、插入或缺失等變化，而且任何一種等位基因在群體中的頻率不小于1%。它是人類可遺傳的變異中最常見(jiàn)的一種，占所有已知多態(tài)性的90%以上，與許多疾病直接相關(guān)，如血友病和苯酮尿病等，是決定人類疾病易感性和藥物反應(yīng)差異的主要因素。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個(gè)堿基對(duì)中就有1個(gè)，估計(jì)其總數(shù)可達(dá)300萬(wàn)個(gè)甚至更多。

探針是能與特異靶分子反應(yīng)并帶有供反應(yīng)后檢測(cè)的合適標(biāo)記物的分子。核酸探針技術(shù)就是利用核苷酸堿基互補(bǔ)配對(duì)的原理，用特異的基因探針即識(shí)別特異堿基序列的一段單鏈DNA（或RNA）分子，與被測(cè)定的靶序列互補(bǔ)，以檢測(cè)被測(cè)靶序列的技術(shù)。目前核酸探針技術(shù)在臨床微生物學(xué)、血液篩選、遺傳病診斷和預(yù)防、法醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，是定性或定量檢測(cè)特異RNA或DNA序列的有力工具。

DNAzyme是通過(guò)體外指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化(SELEX)技術(shù)發(fā)現(xiàn)的具有催化活性的單鏈DNA分子，由于其性質(zhì)穩(wěn)定、易于儲(chǔ)存及化學(xué)合成經(jīng)濟(jì)方便等優(yōu)點(diǎn)贏得眾多科學(xué)家的廣泛關(guān)注。1996年，Dipankar?Sen發(fā)現(xiàn)了能夠折疊成G-四鏈體的富含鳥(niǎo)嘌呤的單鏈DNAzyme。2004年Itamar?Willner研發(fā)出了室溫下能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的催化信標(biāo)，通過(guò)釋放這種能形成G-四鏈體的DNAzyme來(lái)檢測(cè)核酸和端粒酶的活性。這種DNAzyme與卟啉鐵（hemin）或者卟啉鐵類似物結(jié)合后，具有類似于過(guò)氧化物酶的活性，能催化H₂O₂將顯色底物（ABTS，DAB等）氧化成有色物質(zhì)，因此可以直接在室溫下通過(guò)顏色變化來(lái)檢測(cè)核酸。

連接酶依賴的DNA擴(kuò)增技術(shù)是在20世紀(jì)80年代晚期和90年代初期研究DNA連接酶在缺口連接時(shí)的保真性的過(guò)程中取得突破性進(jìn)展的，多用于單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)。連接酶檢測(cè)反應(yīng)(Ligase?detection?reaction,LDR)是通過(guò)一對(duì)與目標(biāo)核酸互補(bǔ)配對(duì)的探針的反復(fù)連接實(shí)現(xiàn)目標(biāo)核酸的線性擴(kuò)增。連接酶擴(kuò)增反應(yīng)(Ligase?amplification?reaction,LAR)或連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Ligase?chain?reaction,LCR)是在連接酶檢測(cè)反應(yīng)(Ligase?detection?reaction,LDR)的基礎(chǔ)上發(fā)明的一種依賴連接酶的DNA指數(shù)擴(kuò)增技術(shù)。它們?cè)贚DR的基礎(chǔ)上引入另外一組與目標(biāo)基因?qū)?yīng)鏈互補(bǔ)配對(duì)的探針，通過(guò)反復(fù)的熱變性、退火和連接進(jìn)而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的指數(shù)擴(kuò)增。該技術(shù)首次實(shí)現(xiàn)體外酶促連接特異DNA片段，能迅速擴(kuò)增放大目的核酸，使后續(xù)的檢測(cè)更靈敏；LCR既可擴(kuò)增，又可測(cè)定DNA異常，其特點(diǎn)是特異性強(qiáng)，靈敏度高。Gap-LCR是一種修飾過(guò)的LCR技術(shù)，是在LCR體系中的分別互補(bǔ)配對(duì)的兩組探針的連接處設(shè)計(jì)一個(gè)堿基的缺口，該缺口處的堿基必須通過(guò)DNA聚合酶進(jìn)行延伸后，才能在連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)，最終實(shí)現(xiàn)Gap-LCR的指數(shù)擴(kuò)增。Gap-LCR技術(shù)能夠避免探針自身引起的平末端的連接反應(yīng)，從而降低背景，增加靈敏度。目前的LCR擴(kuò)增技術(shù)多與同位素標(biāo)記或者熒光修飾相結(jié)合運(yùn)用于單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)，這些方法都在一定程度上存在同位素污染、試劑或者檢測(cè)儀器成本過(guò)高等問(wèn)題。

因此，如何設(shè)計(jì)一種廉價(jià)、有效、經(jīng)濟(jì)、普適的檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)基因組DNA中單核苷酸多態(tài)性是近年來(lái)許多學(xué)者們正在研究的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種SNP的檢測(cè)方法，該方法在缺口-連接酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增技術(shù)的探針上引入DNAzyme序列，該方法是一種不需要特殊修飾的探針和昂貴的檢測(cè)儀器，就能夠迅速、簡(jiǎn)便、并且高靈敏專一地對(duì)血液樣品中單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行定性和定量的檢測(cè)方法。

實(shí)現(xiàn)以上目的的技術(shù)方案如下：

一種DNA的缺口-連接酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增方法，包括以下步驟：

a)根據(jù)目標(biāo)DNA的突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)探針用于缺口-連接酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增，在其中一條磷酸化的DNA探針序列的3端引入DNAzyme序列；