[發明專利]一種檢測單核苷酸多態性的方法

有效

• 申請號: 201310045649.0
• 申請日: 2013-02-05
• 公開（公告）號: CN103103283A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 唐卓;周麗
• 申請（專利權）人: 中國科學院成都生物研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種檢測單核苷酸多態性的方法，其特征是：在連接酶鏈式反應Ligase?Chain?Reaction或者缺口-連接酶鏈式反應Gap-LCR體系中加入兩組探針，其中一個5端磷酸化探針的3端用DNAzyme標記，在進行目標核酸的鏈式連接酶擴增反應過程中，依次在DNA聚合酶和DNA連接酶的作用下將DNAzyme引入到擴增產物中，LCR擴增以后，向擴增的產物中引入能與DNAzyme的序列部分互補的阻斷序列Anti-G，同時加入終濃度為100mM的NaCl以促進Anti-G和DNAzyme更好的形成雙鏈結構，然后利用Lambda外切酶選擇性切割雙鏈DNA中的5端磷酸化的DNA探針，而對連接產物不起作用，此時體系中主要存在著沒有磷酸化的探針和連接產物，接著利用外切酶III降解雙鏈DNA的3端為平末端或者凹陷末端的序列，從DNA鏈的3’端釋放單磷酸核苷酸，產生單鏈DNA片段，將連接產物中的DNAzyme標記釋放，通過檢測LCR消化產物中釋放出的DNAzyme標記物來進行單核苷酸多態性的定性或定量分析；寡核苷酸探針中一般含有一段15個堿基以上的序列能與目標核酸序列互補，阻斷序列Anti-G與DNAzyme序列大約有12個堿基的序列完全互補配對，使DNAzyme序列處于封閉狀態，以保證Lambda外切酶能夠徹底消化LCR擴增反應以后體系中剩余的含DNAzyme序列的磷酸化探針，從而降低檢測背景。

2.根據權利要求1所述的單核苷酸多態性的檢測方法，其特征是：所述寡核苷酸探針中的DNAzyme標記是一種能夠產生信號的、具有過氧化物酶催化功能的DNA序列。

3.根據權利要求1所述的單核苷酸多態性的檢測方法，其特征是：所述核酸聚合酶是一種不具有5’-3’和3’-5’外切酶活性的耐熱性核酸聚合酶。

4.根據權利要求1所述的單核苷酸多態性的檢測方法，其特征是：所述核酸連接酶是一種具有耐熱性的核酸連接酶。

5.根據權利要求1所述的單核苷酸多態性的檢測方法，其特征是：所述的Lambda外切酶是一種5’-3’外切脫氧核糖核酸酶，能選擇性切割雙鏈DNA中的5端磷酸化的DNA序列，對單鏈DNA和未磷酸化DNA的活性較低、對含有切口的DNA無活性、對缺口的DNA活性有限。

6.根據權利要求1所述的單核苷酸多態性的檢測方法，其特征是：所述的外切酶III是一種具有3’-5’的脫氧核糖核酸酶活性的外切酶，降解雙鏈DNA的平末端，5’突出末端或切口，從DNA鏈的3’端釋放5’單磷酸核苷酸，產生單鏈DNA片段；該酶對具有至少有4個堿基且末端不是C殘基的3’突出末端的DNA、單鏈DNA、硫代磷酸酯連接的核苷酸無活性。

7.根據權利要求1所述的單核苷酸多態性的檢測方法，其特征是：所述寡核苷酸探針一般有20個核苷酸與目標核酸序列互補配對，DNAzyme序列不包含在此片段中。