[發(fā)明專利]一種產長鏈二元酸的熱帶假絲酵母菌的誘變方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310045582.0
• 申請日: 2013-02-05
• 公開（公告）號: CN103074325A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發(fā)明（設計）人: 徐杰;王強
• 申請（專利權）人: 徐杰
• 主分類號: C12N15/01
• 分類號: C12N15/01;C12N13/00;C12N1/16;C12R1/74
• 代理公司: 烏魯木齊中科新興專利事務所 65106
• 代理人: 李靜

1.一種產長鏈二元酸的熱帶假絲酵母菌的誘變方法，其特征在于按下列步驟進行：

制備培養(yǎng)基：

a、麥芽汁培養(yǎng)基:12Brix麥芽汁，2%瓊脂；

b、種子培養(yǎng)基：各組份為磷酸二氫鉀5.0-6.0g，氯化鈉1.0-1.5g，七水合硫酸鎂0.5-1.0g，蔗糖15.0-25.0g，玉米漿1.0-2.0g，酵母浸膏1.0-2.0g，尿素2.5-3.0g，維生素B₁0.1-0.3g，正構烷烴C₈-C₁₈40-50ml，純水1000ml；

c、篩選培養(yǎng)基：

篩選培養(yǎng)基Ⅰ：各組份為磷酸二氫鈉2.0-3.0g，磷酸氫二鉀5.0-6.0g，硫酸銨2.0-3.0g，氯化鈉1.0-1.5g，酵母浸膏0.5-1.0g，七水合硫酸鎂0.5-1.0g，瓊脂15.0-20.0g，正構烷烴nC₈-nC₁₈20-50ml，純水1000ml，pH7.0；

篩選培養(yǎng)基Ⅱ：各組份為磷酸二氫鈉2.0-3.0g，磷酸氫二鉀5.0-6.0g，氯化鈉1.0-1.5g，酵母浸膏0.5-1.0g，硫酸銨2.0-3.0g，七水合硫酸鎂0.5-1.0g，瓊脂15.0-20.0g，蔗糖15.0-20.0g，純水1000ml，pH7.0；

篩選培養(yǎng)基Ⅲ：各組份為蔗糖15.0-20.0g，磷酸二氫鈉2.0-3.0g，磷酸氫二鉀5.0-6.0g，氯化鈉1.0-1.5g，七水合硫酸鎂0.5-1.0g，酵母浸膏0.5-1.0g，尿素1.5-2.0g，瓊脂15.0-20.0g，正構烷烴nC₈-nC₁₈20-50ml，純水1000ml，pH7.5，酚紅指示劑1%；

d、發(fā)酵培養(yǎng)基：各組份為磷酸二氫鉀5.0-6.0g，氯化鈉1.0-1.5g，七水合硫酸鎂0.5-1.0g，蔗糖15.0-25.0g，玉米漿1.0-2.0g，酵母浸膏1.0-2.0g，無水醋酸鈉3.0-4.0g，尿素2.0-3.0g，維生素B₁0.1-0.3g，硫酸銨2.0-3.0g，丙烯酸0.001-0.002g，正構烷烴nC₈-nC₁₈300-400ml，純水1000ml；

熱帶假絲酵母菌的誘變：

e、將熱帶假絲酵母菌菌株接入麥芽汁培養(yǎng)基斜面，在溫度28-34℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時，向斜面內加入15ml無菌水，用無菌接種環(huán)將菌體刮入無菌的含有玻璃珠的250ml三角瓶中，振蕩30分鐘充分打散菌體，分別吸取10ml菌懸液于50ml無菌三角瓶中，用鈷60γ-射線進行輻照，輻照劑量為0.5-0.7KGy，將輻照后的菌懸液進行梯度稀釋，并涂麥芽汁平板，在溫度28-34℃的培養(yǎng)箱中與對照平板一起培養(yǎng)36-72小時，選擇經輻照后平板中成活率在10-40%的熱帶假絲酵母菌的單菌落；

f、將步驟e篩選出的平板中成活率在10-40%的單菌落分別一一對應接種到含篩選培養(yǎng)基Ⅰ的平板和含篩選培養(yǎng)基Ⅱ的平板上，在溫度28-34℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36-72小時，選擇在篩選培養(yǎng)基Ⅰ平板上不生長而在篩選培養(yǎng)基Ⅱ平板上生長旺盛的熱帶假絲酵母菌的單菌落；

g、再將步驟f篩選出的單菌落接種于含篩選培養(yǎng)基Ⅲ的平板上，在溫度28-34℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36-72小時，選擇R值大的熱帶假絲酵母菌的誘變菌株，其中R為菌落產酸面積/菌落面積；

熱帶假絲酵母菌誘變菌株的驗證

h、將步驟g得到的熱帶假絲酵母菌的誘變菌株按常規(guī)方法接種到步驟b種子培養(yǎng)基進行種子培養(yǎng)，再將培養(yǎng)好的種子接種到步驟d發(fā)酵培養(yǎng)基中進行產酸培養(yǎng)。