[發明專利]一種新型高效的蛋白酶活性檢測方法

有效

• 申請號: 201310045562.3
• 申請日: 2013-02-05
• 公開（公告）號: CN103149185A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 馬楠;何學文
• 申請（專利權）人: 蘇州大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司 32103
• 代理人: 馬明渡

技術領域

本發明涉及功能納米材料和生物化學領域，具體涉及一種新型高效的蛋白酶活性檢測方法，本發明通過蛋白酶對多肽底物的酶切反應，用所得的酶切產物作為表面配體來合成具有熒光效應的納米材料量子點，然后再根據所合成的量子點的熒光效應的變化，來反映酶切反應后產物的變化，從而來反映蛋白酶活性的變化。

背景技術

蛋白酶對蛋白質和多肽底物的特異性催化水解反應，對于生物體的正常生命活動發揮著極其重要的作用。檢測酶含量及存在，很難直接用酶的量（例如質量、體積、濃度）來表示，而常用酶催化某一特定化學反應的能力來表示酶量，即用酶活性來表示。研究表明，蛋白酶活性的失調能夠引起疾病，如癌癥，炎癥、退化性疾病等，這已經引起了科學家的廣泛關注，因此在研究中需要檢測蛋白酶的活性，檢測蛋白酶的活性在蛋白酶活性相關疾病的醫學診斷和工業生產方面都具有十分重要的意義。傳統的酶活性檢測方法，如免疫熒光吸附方法(簡稱ELISA)，Tothill的研究表明免疫熒光吸附方法雖然方便，但其靈敏度有限；Lamore?S.?D.提出雖然質譜和凝膠電泳方法的檢測靈敏度高，但是需要昂貴的儀器設備，且不能定量；Lee?J.?S.等的研究表明熒光共振能量轉移方法的靈敏度雖高，但由于底物的局限性，使其不具備普適性。因此，如何設計一種高效的、方便快捷、成本低的新型蛋白酶活性檢測方法成為本發明研究的課題。

發明內容

本發明目的是提供一種新型高效的蛋白酶活性檢測方法，其目的在于解決目前蛋白酶檢測方法靈敏度有限、成本較高以及不具備普遍適用性的問題。

為達到上述目的，本發明采用的技術方案是：一種新型高效的蛋白酶活性檢測方法，有兩個部分組成，?

第一部分：

事先建立所需檢測的蛋白酶活性與對應產物合成的量子點的熒光光譜波峰強度之間的相關關系，所述相關關系的建立由下列步驟組成：

第一步，針對所需檢測的蛋白酶的種類，設計一段含有該蛋白酶特異性切割位點的多肽底物；

所述蛋白酶的種類是指具有特異性切割位點的胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、凝血酶、木瓜蛋白酶、膠原酶、基質金屬蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、氨基肽酶、羧肽酶中的任意一種；

所述多肽底物中包含一段由2~10個氨基酸構成的肽鏈，所述肽鏈中含有能夠被所述蛋白酶特異性切割的肽鍵以及兩個帶有巰基基團的半胱氨酸，其中，肽鏈的兩端分別是一個帶有巰基基團的半胱氨酸；

第二步，在第一步的基礎上，在所需檢測的蛋白酶的最適溫度以及最適pH值條件下，向多組相同量的多肽底物中各投入已知濃度的蛋白酶，各組已知濃度的蛋白酶之間具有濃度梯度，然后進行酶切反應，得到各組酶切產物，其中，多組已知濃度的蛋白酶中的最高濃度為所述多肽底物摩爾濃度的0.5%~10?%，設定的每一組酶切反應的時間相同并且小于或等于最高濃度的蛋白酶100%酶切多肽底物的時間；投入的所述多肽底物中含有的巰基基團的摩爾濃度在0.5?~10mmol/L之間；

第三步，向所述各組酶切產物中投入相同量的用于合成量子點的具有金屬離子和非金屬離子的前驅體，并在25~100℃下反應0.5~1小時，各組反應結束后生成量子點，其中，投入的所述前驅體中金屬離子的摩爾濃度為所述多肽底物中含有的巰基基團的摩爾濃度的85~120%，非金屬離子的摩爾濃度為金屬離子摩爾濃度的20?%~100?%；

所述金屬離子的前驅體選自鎘化合物、鉛化合物、銀化合物、鋅化合物、銦化合物、汞化合物、銅化合物、錳化合物中的任意一種或任意兩種，所述非金屬離子的前驅體選自含硫化合物、含硒化合物、含碲化合物、含磷化合物、含砷化合物中的任意一種或任意兩種；但任意兩種金屬離子的前驅體與任意兩種非金屬離子的前驅體不同時應用于一個合成量子點的反應；

所述量子點是二元量子點，具體為碲化鎘、硒化鎘、硫化鎘、硫化鉛、硒化鉛、硫化銀、硒化銀、硫化鋅、硒化鋅、碲化鋅、磷化鎘、砷化鎘、磷化銦、砷化銦中的任意一種，或者所述量子點是三元量子點，具體為鎘汞碲、鎘汞硒、鎘汞硫、鋅汞碲、鋅汞硒、鋅汞硫、鋅鎘碲、鋅鎘硒、鋅鎘硫，鋅碲硒，鋅碲硫、鋅硒硫、鎘碲硒、鎘碲硫、鎘硒硫、鋅銅硒、鋅錳硒、銅銦硫、銅銦硒中的任意一種；

第四步，對第三步中各組生成的量子點進行熒光光譜測定，得到所述量子點的熒光光譜波峰強度，再根據所需檢測的多組蛋白酶的已知濃度，最終得到蛋白濃度與對應產物合成的量子點的熒光光譜波峰強度之間的相關關系，即蛋白酶活性與對應產物合成的量子點的熒光光譜波峰強度之間的相關關系；

第二部分：