[發(fā)明專利]一種新型高效的蛋白酶活性檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310045562.3
• 申請日: 2013-02-05
• 公開（公告）號(hào): CN103149185A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬楠;何學(xué)文
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64
• 代理公司: 蘇州創(chuàng)元專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 32103
• 代理人: 馬明渡

1.一種新型高效的蛋白酶活性檢測方法，其特征在于：

第一部分：

事先建立所需檢測的蛋白酶活性與對應(yīng)產(chǎn)物合成的量子點(diǎn)的熒光光譜波峰強(qiáng)度之間的相關(guān)關(guān)系，所述相關(guān)關(guān)系的建立由下列步驟組成：

第一步，針對所需檢測的蛋白酶的種類，設(shè)計(jì)一段含有該蛋白酶特異性切割位點(diǎn)的多肽底物；

所述蛋白酶的種類是指具有特異性切割位點(diǎn)的胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、凝血酶、木瓜蛋白酶、膠原酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、氨基肽酶、羧肽酶中的任意一種；

所述多肽底物中包含一段由2~10個(gè)氨基酸構(gòu)成的肽鏈，所述肽鏈中含有能夠被所述蛋白酶特異性切割的肽鍵以及兩個(gè)帶有巰基基團(tuán)的半胱氨酸，其中，肽鏈的兩端分別是一個(gè)帶有巰基基團(tuán)的半胱氨酸；

第二步，在第一步的基礎(chǔ)上，在所需檢測的蛋白酶的最適溫度以及最適pH值條件下，向多組相同量的多肽底物中各投入已知濃度的蛋白酶，各組已知濃度的蛋白酶之間具有濃度梯度，然后進(jìn)行酶切反應(yīng)，得到各組酶切產(chǎn)物，其中，多組已知濃度的蛋白酶中的最高濃度為所述多肽底物摩爾濃度的0.5%~10?%，設(shè)定的每一組酶切反應(yīng)的時(shí)間相同并且小于或等于最高濃度的蛋白酶100%酶切多肽底物的時(shí)間；投入的所述多肽底物中含有的巰基基團(tuán)的摩爾濃度在0.5?~10mmol/L之間；

第三步，向所述各組酶切產(chǎn)物中投入相同量的用于合成量子點(diǎn)的具有金屬離子和非金屬離子的前驅(qū)體，并在25~100℃下反應(yīng)0.5~1小時(shí)，各組反應(yīng)結(jié)束后生成量子點(diǎn)，其中，投入的所述前驅(qū)體中金屬離子的摩爾濃度為所述多肽底物中含有的巰基基團(tuán)的摩爾濃度的85~120%，非金屬離子的摩爾濃度為金屬離子摩爾濃度的20?%~100?%；

所述金屬離子的前驅(qū)體選自鎘化合物、鉛化合物、銀化合物、鋅化合物、銦化合物、汞化合物、銅化合物、錳化合物中的任意一種或任意兩種，所述非金屬離子的前驅(qū)體選自含硫化合物、含硒化合物、含碲化合物、含磷化合物、含砷化合物中的任意一種或任意兩種；但任意兩種金屬離子的前驅(qū)體與任意兩種非金屬離子的前驅(qū)體不同時(shí)應(yīng)用于一個(gè)合成量子點(diǎn)的反應(yīng)；

所述量子點(diǎn)是二元量子點(diǎn)，具體為碲化鎘、硒化鎘、硫化鎘、硫化鉛、硒化鉛、硫化銀、硒化銀、硫化鋅、硒化鋅、碲化鋅、磷化鎘、砷化鎘、磷化銦、砷化銦中的任意一種，或者所述量子點(diǎn)是三元量子點(diǎn)，具體為鎘汞碲、鎘汞硒、鎘汞硫、鋅汞碲、鋅汞硒、鋅汞硫、鋅鎘碲、鋅鎘硒、鋅鎘硫，鋅碲硒，鋅碲硫、鋅硒硫、鎘碲硒、鎘碲硫、鎘硒硫、鋅銅硒、鋅錳硒、銅銦硫、銅銦硒中的任意一種；

第四步，對第三步中各組生成的量子點(diǎn)進(jìn)行熒光光譜測定，得到所述量子點(diǎn)的熒光光譜波峰強(qiáng)度，再根據(jù)所需檢測的多組蛋白酶的已知濃度，最終得到蛋白濃度與對應(yīng)產(chǎn)物合成的量子點(diǎn)的熒光光譜波峰強(qiáng)度之間的相關(guān)關(guān)系，即蛋白酶活性與對應(yīng)產(chǎn)物合成的量子點(diǎn)的熒光光譜波峰強(qiáng)度之間的相關(guān)關(guān)系；

第二部分：

針對胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、凝血酶、木瓜蛋白酶、膠原酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、氨基肽酶、羧肽酶中的任意一種，蛋白酶活性檢測方法由以下步驟組成：

第一步，設(shè)計(jì)多肽底物

針對被檢測的蛋白酶種類，設(shè)計(jì)一段與所述第一部分的第一步中相同的多肽底物；

第二步，進(jìn)行酶切反應(yīng)

設(shè)計(jì)好多肽底物后，在被檢測的蛋白酶的最適溫度以及最適pH值條件下，向多肽底物中投入未知濃度的被檢測蛋白酶，然后進(jìn)行酶切反應(yīng)，得到酶切產(chǎn)物；其中，酶切反應(yīng)的時(shí)間與所述第一部分的第二步中酶切反應(yīng)時(shí)間相同，所述多肽底物的量與所述第一部分的第二步中多肽底物的量相同；

第三步，合成量子點(diǎn)

向第二步中的酶切產(chǎn)物中投入用于合成量子點(diǎn)的所述第一部分的第三步中的前驅(qū)體，并在與所述第一部分的第三步中相同的溫度以及時(shí)間條件下反應(yīng)，結(jié)束后生成量子點(diǎn)，其中，投入的所述前驅(qū)體中金屬離子和非金屬離子的量與所述第一部分的第三步中前驅(qū)體中金屬離子和非金屬離子的量相同；

第四步，獲得被檢測的未知濃度的蛋白酶的活性

對第三步中生成的量子點(diǎn)進(jìn)行熒光光譜測定，得到該量子點(diǎn)的熒光光譜波峰強(qiáng)度，再將該熒光光譜波峰強(qiáng)度與所述第一部分中得到的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行比對，最終獲得被檢測的未知濃度的蛋白酶活性。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：在所述第一部分的第二步與所述第二部分的第二步中，所述pH值采用pH緩沖溶液來調(diào)節(jié)。