[發明專利]十字花科蔬菜根腫病菌熒光定量PCR檢測技術及應用

無效

• 申請號: 201310044418.8
• 申請日: 2013-02-05
• 公開（公告）號: CN103966307A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發明（設計）人: 謝學文;李金萍;李寶聚;石延霞;柴阿麗
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蔬菜花卉研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明為一種十字花科蔬菜根腫病菌的熒光定量PCR檢測技術及應用，專用于檢測十字花科蔬菜根腫病菌，屬于農作物病害診斷與防治技術領域。

背景技術

蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicae）引起十字花科蔬菜的根腫病，主要寄生于蕓苔屬多種植株的根部。在全世界均有分布，近年來其危害范圍從十字花科蔬菜擴展到一些花卉植物，侵染栽培及野生植物100個種（變種）以上。根腫病每年造成的世界范圍內的損失達到10-15%。感病植株被根腫菌侵染后形成根腫組織，植株矮小、易萎蔫（Voorips，1995)。病原菌從腐爛的根腫組織中釋放出來形成休眠孢子能夠存活很多年（Wallenhammar，1996）。根腫菌休眠孢子萌發和侵染的最適土溫為18～25℃，最適土壤持水量為70%，最適土壤酸堿度為5.4～6.5（李寶聚，2008）。根腫菌休眠孢子在感病寄主根系分泌物的溶液中萌發率可以達到75％（肖崇剛，2002）。在蕓薹屬植株重復種植的過程中這些休眠孢子在土壤中逐漸積累，病害程度逐年加重（Robert等2009）。

在病害癥狀明顯表現之前不容易預測和避免根腫病菌的侵染，甚至在農民認為沒有根腫病侵染或田間無病菌的情況下，根腫菌的休眠孢子已經悄無聲息地從一個地方的土壤以及水中傳播到另一個地方，由于上述種種原因導致十字花科蔬菜根腫病的防治十分困難，因此，發展有效且快速的十字花科根腫病菌檢測技術，有效的避免該病的蔓延和傳播，對于十字花科根腫病的防治具有十分重要的意義。

由于根腫病菌不能直接培養，它的常規土壤檢測依賴于感病植株的生測實驗，或者通過根部的癥狀直接評估，或者通過顯微鏡檢測根腫菌侵染情況（Toxopeus等1975）。近來，熒光顯微鏡，免疫學和建立在DNA基礎上的檢測方法逐漸應用于檢測土壤，水或植株樣品中的根腫菌。這些檢測方法不夠快速，并且不能對植株、水以及土壤樣品中的根腫菌進行定量，隨著分子診斷技術在醫學、畜牧學以及植物病理學的廣泛應用，并且一方面從診斷單一靶標到雙重以及多重PCR方向發展，另一方面從定性PCR向實時熒光定量PCR（RTi-PCR）方向發展，這為我們對植株、土壤以及水中根腫菌的快速檢測提供了強有力的基礎。

RT-PCR是通過PCR在指數擴增期間連續檢測熒光信號的強弱來即時檢測特異性產物的量，并據此評估目的基因的起始模板量。與常規PCR相比，具有操作簡便、高效快速、敏感性強、可重復性好和特異性高的優點。SYBR GreenⅠ熒光定量PCR的工作原理是在常規PCR的體系中加入熒光染料SYBR GreenⅠ，SYBR GreenⅠ是一種結合于雙鏈DNA小溝中的熒光染料，與雙鏈DNA結合后，其熒光大大增強。在PCR反應體系中加入過量的SYBR GreenⅠ熒光染料，熒光染料能夠特異性地摻入到DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的熒光染料分子不發射任何熒光信號。從而隨著PCR反應的進行，保證熒光信號的增強與PCR產物增加完全同步，信號增強到某一閾值的循環次數（用循環閾值Ct表示）被記錄下來，Ct值和PCR體系中起始模板的對數之間有嚴格的線性關系，利用陽性定量標準品擴增的Ct值和標準曲線，再根據待測樣品的Ct值就可以準確計算出起始模板中某核酸的存在及數量。

發明內容

本發明的目的在于克服根腫菌傳統檢測方法的不足，提供一種根腫菌的熒光定量PCR快速檢測的方法。

本發明的另一個目的在于提供一種熒光定量PCR檢測技術在十字花科蔬菜根腫病流行監測預報，土壤帶菌以及種子帶菌檢測方面的應用。

該檢測技術，在植物病害診斷與防治領域可以大規模推廣。

本發明的目的通過以下技術方案實現：

該方法的實驗步驟為：從待測樣本提取DNA；將加入標準品及待測樣品的熒光定量反應液上機，用熒光定量檢測儀進行PCR檢測；通過比較待測樣品和標準品的循環閾值，根據標準曲線計算出待測樣品的起始DNA濃度。

本發明的技術具體包括如下步驟：

1、取田間自然發病土壤、發病植株、十字花科蔬菜種子，進行總DNA的提取純化，得到DNA樣本；