[發明專利]十字花科蔬菜根腫病菌熒光定量PCR檢測技術及應用

無效

• 申請號: 201310044418.8
• 申請日: 2013-02-05
• 公開（公告）號: CN103966307A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發明（設計）人: 謝學文;李金萍;李寶聚;石延霞;柴阿麗
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蔬菜花卉研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種十字花科蔬菜根腫病菌的熒光定量PCR檢測技術，其特征在于包括以下步驟：

取田間自然發病土壤、發病植株、十字花科蔬菜種子，進行總DNA的提取純化，得到DNA樣本；

特異性引物設計，在系統分析根腫病菌的ITS區、18SrRNA和5.8rRNA核酸序列系統發育的基礎上，采用CLUSTAL，與根腫菌綱及土傳病原菌的該區序列進行比較，尋找根腫病菌的特異性序列區域，設計特異性引物對1（PBF2/PBR2），引物對2（PBF3/PBR3），所述的引物對為：

引物對1 正向引物5^，-CTTGCGTGTCGCTGTATTC-3^，

^{反向引物5，-ATAGGTTGGGGTAACTTGGC-3，；}

引物對2 正向引物5^，-CTCACAACGATGAAGAAC-3^，

反向引物5^，-ACTCACAGCCAAAGACAAGC-3^，

3） 實時熒光定量PCR反應體系為：熒光定量PCR反應體系總體積為25μl，其中SYBR Premix Ex Taq(內含TaKaRa Ex Taq TM HS，dNTP Mixture，Mg²⁺和 SYBR GreenⅠ) 12.5μl，濃度為10μmol/L的正義引物PBF2（PBF3）和反義引物PBR2（PBR3）各0.5μl，標準品10倍梯度稀釋液或待檢測樣品DNA溶液2μl，ddH₂O補齊至25μl；

4）PCR反應程序為：PCR采用兩步法，95℃3min，接著進行40個循環，每個循環包括95℃10s、60 ℃30s；PCR完成后，按0.1℃ s^-1升溫速率從72℃升至95℃進行融解曲線的分析驗證；

5）插入ITS區的pMD-20載體轉化大腸桿菌DH5α增殖后提取的質粒基因組DNA，DNA經紫外分光光度計A260定量并10倍梯度稀釋，稀釋成6個濃度梯度，按照上述PCR反應體系和程序進行擴增；反應結束后，根據各個濃度梯度的循環閾值（Ct）采用計算機自動繪制熒光定量PCR標準曲線；

6）取步驟1）中得到的DNA樣本作為模板，按上述熒光定量PCR反應體系和反應程序在實時熒光定量PCR儀上進行擴增，并同時進行陰性對照和陽性對照的擴增，其中陰性對照采用ddH₂O，陽性對照采用根腫菌菌株基因組DNA；反應結束后，將DNA樣本的循環閾值（Ct）與標準曲線對照，得到DNA樣本中的ITS區基因片段拷貝數，進而得到原來樣本中根腫病菌的濃度。

2.權利要求書1所述的檢測十字花科蔬菜根腫病的熒光定量PCR檢測技術可以轉化成商品化的試劑盒，試劑盒包括：正義引物PBF2、反義引物PBR2（正義引物PBF3、反義引物PBR3）、熒光染料SYBR Premix Ex Taq 內含TaKaRa Ex Taq TM HS，dNTP Mixture，Mg²⁺和 SYBR GreenⅠ、以及由插入ITS區的pMD-20載體轉化大腸桿菌DH5α增殖后提取的質粒DNA，DNA經紫外分光光度計A260定量并10倍梯度稀釋。

3.該技術可以應用于對農田環境中，包括對土壤中越冬菌量和十字花科蔬菜植株上根腫病菌進行實時監測，以及檢測十字花科蔬菜種子帶菌和田間灌溉水中的根腫病菌。