[發(fā)明專利]一類兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的特異性探針底物及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310044369.8
• 申請日: 2013-02-04
• 公開（公告）號: CN103193746A
• 公開（公告）日: 2013-07-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊凌;夏楊柳;葛廣波;孫曉宇;寧靜;何桂元
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
• 主分類號: C07D311/16
• 分類號: C07D311/16;C12Q1/48
• 代理公司: 沈陽晨創(chuàng)科技專利代理有限責(zé)任公司 21001
• 代理人: 張晨

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一類兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的特異性探針底物及其應(yīng)用。?

背景技術(shù)

兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（COMT）是哺乳動物體內(nèi)廣泛分布的一種甲基化轉(zhuǎn)移酶，其主要生理功能是負責(zé)代謝內(nèi)源性的神經(jīng)遞質(zhì)（如腎上腺素，去甲腎上腺素以及多巴胺等）和外源性的兒茶酚內(nèi)化合物。在人體中，COMT酶有兩種存在形式，一種是溶解性的COMT(S-COMT)，另一種是膜結(jié)合型的COMT(MB-COMT)。COMT在人體的多種組織中都有分布，如腎臟，肝臟，肺等，在人體的大腦中，主要存在于突觸后神經(jīng)元。在人體的大多數(shù)組織中，而S-COMT的量是MB-COMT的3-4倍左右。在人腦中，COMT酶主要以MB-COMT的形式存在，占總量的70%，S-COMT占30%。?

COMT酶的活性在人體中呈基因多態(tài)性，分別表現(xiàn)為低活性(COMTLL)，中等活性(COMTLH)和高活性(COMTHH)。有研究表明，人體中的低COMT活性和酒精中毒、抑郁癥和乳腺癌都有相關(guān)性，因此，定量測定人體組織及細胞中的COMT活性對于多種疾病的臨床診斷和治療具有重要指導(dǎo)意義。另外，由于COMT還是帕金森病治療的一個重要靶點，利用探針反應(yīng)并借助體外代謝孵育體系可高通量的篩選和評價COMT抑制劑，對于帕金森病治療藥物的發(fā)現(xiàn)意義重大。?

目前，最常用的COMT酶的探針底物有四個，包括原兒茶酸，左旋多?巴，多巴胺以及腎上腺素。后三者由于是人體中的內(nèi)源性物質(zhì)，因此無法作為體內(nèi)探針使用。此外，以上COMT酶的探針底物包括原兒茶酸在哺乳動物COMT酶的催化下分別生成兩個單甲基化產(chǎn)物，而兩個產(chǎn)物由于結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)相近，在液相色譜上通常難以分離，給其定量檢測帶來了不便。因此，急需尋找代謝產(chǎn)物單一，檢測靈敏的COMT酶探針底物，同時安全性高，體內(nèi)代謝路徑明確的COMT酶探針底物一直未見報道，也亟待開發(fā)。?

目前，COMT的體外評價體系主要包括哺乳動物的紅細胞，以及亞細胞組分及等，其中亞細胞組分主要包括肝臟組織的S9、胞漿以及腦組織勻漿等成分。采用這些標(biāo)準(zhǔn)化的評價體系，結(jié)合相應(yīng)的輔因子（SAM）和孵育條件，可通過檢測探針底物的代謝清除或產(chǎn)物生成速率，對上述各種體系中表達的COMT酶活性進行表征。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一類兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的特異性探針底物及其應(yīng)用，該特異性探針底物是B環(huán)7,8位具有羥基的香豆素兒茶酚類化合物，與目前已報道的探針底物原兒茶酸相比，這類7,8-二羥基香豆素兒茶酚類化合物對COMT具有更高的選擇性，在人肝等生物樣品中也可用于COMT酶活性的評估與測定，對評估個體樣本的酶活差異具有重要意義。?

本發(fā)明提供了一類兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的特異性探針底物，該特異性探針底物為7,8-二羥基香豆素類化合物，其結(jié)構(gòu)式見式（1），其中R₁為-CH₃、-Ph中的一種，R₂為-H、-OCH₃中的一種。?

本發(fā)明還提供了一種利用所述特異性探針底物定量測定生物體系中COMT酶活的方法，采用上述式（1）化合物作為底物，該類底物在COMT酶的催化下僅選擇性生成1個代謝產(chǎn)物（7-O-甲基化產(chǎn)物），通過定量檢測單位時間內(nèi)甲基化產(chǎn)物的生成量來測定各生物樣品及細胞中COMT酶的活性；具體測定方法為：?

——體系中以這類7,8-二羥基香豆素兒茶酚類化合物中的一種作為特異性探針底物；底物濃度選擇1/10~10K_m；?

——在具有輔因子COMT中，反應(yīng)溫度為20℃至60℃之間，優(yōu)選37℃為最優(yōu)反應(yīng)時間；孵育體系pH介于5.5~10.5之間。?

——反應(yīng)時間為10-120分鐘，在確保以上底物相應(yīng)的7位甲基化產(chǎn)物達到定量限且底物轉(zhuǎn)化率低于10%時終止反應(yīng)；?

——測定單位時間內(nèi)甲基化產(chǎn)物的生成量作為COMT酶活性的評價指標(biāo)。?

本發(fā)明提供的所述特異性探針底物的應(yīng)用，該特異性探針底物用于人及哺乳動物組織制備液及各類組織細胞中COMT酶活的定量測定。?

其中檢測甲基化產(chǎn)物的生成量的定量檢測方法為紫外吸收光譜、質(zhì)譜、放射性同位素示蹤技術(shù)、熒光激發(fā)光譜、蒸發(fā)光散射或電化學(xué)光譜檢測。所有檢測器包括紫外吸收光譜檢測器、質(zhì)譜、放射性同位素示蹤技術(shù)、蒸?發(fā)光散射或電化學(xué)光譜檢測器中的一種或多種串聯(lián)。?