[發明專利]一種油菜單粒種子基因組DNA高通量快捷提取方法

無效

• 申請號: 201310044228.6
• 申請日: 2013-02-05
• 公開（公告）號: CN103060311A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 陳鋒;張潔夫;戚存扣;陳松;浦慧明;付三雄
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

技術領域

????本發明涉及一種油菜單粒種子基因組DNA提取方法，屬于生物技術領域。

背景技術

隨著現代分子生物學研究的深入發展，各種生物技術方法日益成熟，尤其是基于PCR的分子標記技術，在種子純度鑒定、種子轉基因檢測、種質資源多樣性研究等領域廣泛應用。DNA是生物遺傳信息的載體，無論是分子標記技術還是遺傳轉化和鑒定，前提都是基因組DNA的提取。

目前用于油菜?DNA?提取的方法有SDS法、CTAB法、高鹽法和試劑盒法，提取方法已被很多研究人員優化，但大多針對油菜葉片進行，取材時需要油菜生長到一定的階段，這個過程需要較長的時間，所以利用油菜葉片提取DNA的方法不利于在種子快速檢測中推廣使用。如何快速簡便的從油菜種子中提取出基因組DNA，科研人員一直在做著探索。張富麗等（農業科學與技術(英文版)，2012年第13卷第3期485-488）將多粒種子混合，打磨成粉,取100mg粉末加入高鹽提取液抽提基因組DNA，該方法雖然省去了油菜成苗，避免了液氮研磨，但使用了苯酚、氯仿等有毒有機溶劑，步驟仍然比較繁瑣；謝景梅等（作物雜志，2012年第1期17-21）直接以油菜干種子和發芽種子提取基因組DNA，采用改良的CTAB法，提取效果較好，但該方法仍然需要液氮研磨、氯仿抽提等步驟，并未有多大改進。

綜上所述，目前提取油菜基因組DNA的方法普遍存在著操作繁瑣、提取時間長、陳本較高等不足之處。另外，以油菜單粒種子為材料的基因組DNA提取報道較少，但油菜雜交種為了保證純度，從田間收獲到包裝之前有限的時間內，必須進行雜種純度鑒定，需要快速提取油菜單粒種子的基因組DNA，之前的DNA提取方法不適應這種需要。

發明內容

技術問題

本發明所要解決的技術問題是提供一種油菜單粒種子基因組DNA快捷提取方法，用該方法提取油菜種子基因組DNA時間短、陳本低、操作簡便、高通量、后續DNA吸取方便，提取的DNA產量和質量完全滿足PCR反應的需要。

技術方案

本發明提供的技術方案是：一種油菜單粒種子基因組DNA高通量快捷提取方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)?發芽：在培養皿內鋪濾紙，加水至完全濕潤濾紙，將油菜種子均勻撒在濾紙上，蓋上培養皿蓋，放入培養箱中，37℃暗培養12-16小時至根長3-5mm；

(2)?取材：將破皮萌發的油菜種子去種皮，放入0.2mL?96孔PCR板，每孔一粒；

(3)?裂解：每孔加20μL?0.25mol/L?NaOH，在PCR儀上99.9℃?1min；

(4)?提取：每孔加5μL?1mol/L?HCl中和，再加入25μL?0.5mol/L?Tris-HCl(pH8.0)，在PCR儀上99.9℃?3min；

(5)?沉淀：待PCR板自然冷卻，用鑷子取出提取液中油菜種子，加入100μL?預冷無水乙醇，蓋上PCR板封口膜，上下搖勻20次；

(6)?離心：板式離心機離心PCR板，3000rpm，10min，棄上清；

(7)?干燥：將PCR板置入真空干燥儀，35℃真空干燥5min；

(8)?溶解：每管加入50μL滅菌ddH₂O，37℃完全溶解DNA，4℃保存。

有益效果?

本發明以油菜芽種為材料，快速基因組DNA的方法，次方法具有如下優點：

(1)?所需用于提取基因組DNA的材料為油菜單粒種子，只需將種子發芽，省去成苗的步驟，節省了材料準備時間，為油菜種子質量的快速鑒定以及油菜種質資源分子水平上的多樣性研究提供了高效可行的技術途徑。

(2)?簡化了操作步驟，使用0.2mL?96孔PCR板，配合多通道移液器，用PCR儀加溫代替水浴，提取全程操作簡便迅速，能在短時間內提取大量樣品DNA，一個熟練的科研人員在8小時工作時間內至少能完成10×96個單粒種子DNA的提取，具有高通量提取的優點，比常用的CTAB、SDS等方法的提取效率高5倍以上。

(3)?提取的基因組DNA質量較高，瓊脂糖凝膠檢測電泳條帶清晰，降解少，紫外分光廣度計測得濃度在90-125ng/μL之間，可以直接用于PCR反應，完全滿足PCR擴增的需要。

(4)?相對其他方法，無需液氮研磨，無需種子粉碎，無需氯仿抽提，所用試劑顯著減少，節本高效。

附圖說明

圖1為本發明方法提取的油菜單粒種子基因組DNA?的電泳圖，其中，M：5kb?DNA?Marker；其他：油菜單粒種子基因組DNA。